Initiation à la chromatographie en phase liquide (LC)

Un tube de colonne et ses raccords doivent contenir le matériau de remplissage chromatographique (phase stationnaire) utilisé pour effectuer une séparation. Il doit résister à la pression exercée pendant sa fabrication et son utilisation. En outre, il doit fournir un circuit fluidique bien contrôlé (sans fuite, à volume minimal et à volume mort nul) pour l’échantillon à son entrée et pour les bandes d’analytes à sa sortie, et être chimiquement inerte par rapport au système chromatographique (phases de l’échantillon, mobile et stationnaire). La plupart des colonnes sont fabriquées en acier inoxydable pour une résistance maximale à la pression. Le PEEK (un plastique spécial) et le verre résistent moins bien à la pression, mais peuvent être utilisés lorsque des surfaces inertes sont requises pour des applications chimiques ou biologiques spéciales. (Figure M-1).

Une paroi de colonne en verre offre un avantage visuel. Sur la photo de la figure M-2, le débit a été arrêté alors que les bandes d’échantillon se trouvaient encore dans la colonne. Vous pouvez constater que les trois colorants du mélange d’échantillon injecté se sont déjà séparés dans le lit ; l’analyte jaune, qui se déplace le plus vite, est sur le point de sortir de la colonne.

Performances de séparation – Résolution

Le degré de séparation de deux composés est appelé « résolution chromatographique », ou RS. Les deux principaux facteurs qui déterminent le pouvoir de séparation global, autrement dit la résolution, pouvant être obtenu par une colonne HPLC sont les suivants : le pouvoir de séparation mécanique, créé par la longueur de la colonne, la granulométrie et l’uniformité du lit, d’une part, et, d’autre part, le pouvoir de séparation chimique, produit par la concurrence physico-chimique pour les composés entre la phase stationnaire (matériau de remplissage) et la phase mobile. L’efficacité est une mesure du pouvoir de séparation mécanique, tandis que la sélectivité est une mesure du pouvoir de séparation chimique.

Pouvoir de séparation mécanique – Efficacité

Si un lit de colonne est stable et rempli de manière uniforme, son pouvoir de séparation mécanique est déterminé par la longueur de la colonne et sa granulométrie. Le pouvoir de séparation mécanique, également appelé « efficacité », est souvent mesuré et comparé à l’aide d’un nombre de plateaux (symbole = N). Les lits de colonnes à particules plus petites présentent une efficacité et une pression plus élevées. Pour une même granulométrie, l’augmentation de la longueur de colonne permet d’accroître le pouvoir de séparation mécanique. Toutefois, cela implique également des temps d’analyse chromatographique plus longs, une consommation de solvant plus importante et une pression plus élevée. Des longueurs de colonne plus courtes réduisent toutes ces variables, mais également le pouvoir de séparation mécanique, comme le montre la figure N.

Pour une chimie de particule, une phase mobile et un débit donnés, comme le montre la figure O, une colonne de même longueur et de même diamètre interne, mais avec une granulométrie inférieure, fournira simultanément un plus grand pouvoir de séparation mécanique. Cependant, sa pression sera nettement supérieure.

Pouvoir de séparation chimique – Sélectivité

Le choix d’une combinaison de chimie de particule (phase stationnaire) et de composition de phase mobile, à savoir le système chromatographique, déterminera le degré de pouvoir de séparation chimique (la façon dont nous modifions la vitesse de chaque analyte). L’optimisation de la sélectivité est le moyen le plus efficace de produire une séparation ; elle permet d’éviter d’avoir recours à la force brute de l’efficacité mécanique la plus élevée possible. Pour séparer deux composés spécifiques, un scientifique peut choisir parmi une multitude de combinaisons de phases (phase stationnaire et phase mobile) et de mécanismes de rétention (modes de chromatographie). Ceux-ci sont abordés dans la section suivante.