Abordagens práticas para o isolamento de peptídeos

Seleção de coluna

Idealmente, utilizar um recheio de coluna para todas as amostras, incluindo peptídeos comuns (com uma mistura de resíduos ácidos, básicos e não polares), peptídeos básicos, peptídeos grandes (30 a 40 resíduos) e peptídeos hidrofóbicos, reduz o inventário da coluna e elimina a necessidade de filtrar várias colunas para cada amostra bruta. Embora as fases do C₁₈ sejam normalmente utilizadas para muitas separações de peptídeos, a partícula de base à qual o C₁₈ está ligado também é um fator crítico que influencia a retenção cromatográfica, a resolução e o formato de pico. As Colunas BEH XBridge para peptídeos são baseadas em partículas híbridas de pontes de etileno em vez de sílica pura. A partícula BEH (híbrida de sílica/pontes de etilsiloxano, Ethylsiloxane/Silica Hybrid) (Figura 7) minimiza interações secundárias com peptídeos e é estável em pH alto e baixo para máxima flexibilidade no desenvolvimento de separações. O material de retenção sintético está disponível com poros de 130 Å ou 300 Å em tamanhos de partícula de 3,5, 5 e 10 µm. Para amostras atípicas ou peptídeos extremamente hidrofóbicos, a mesma partícula de base está disponível com fases ligadas de C₈ ou C₄.

As capacidades aproximadas de carregamento de massa de peptídeos em várias dimensões da coluna são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1. Capacidade aproximada de carregamento de massa de peptídeos para fase reversa

*Colunas preparativas OBD de 5 µm e 10 µm; **Colunas preparativas OBD de 10 µm.

Diversos fatores afetam a capacidade de massa das colunas preparativas. As capacidades listadas representam uma estimativa "média" com taxas de fluxo e volumes de injeção razoáveis para cada dimensão. Os seguintes fatores devem ser considerados:
1) A capacidade para peptídeos depende principalmente da solubilidade da amostra em particular.
2) A capacidade é menor onde é necessária uma resolução mais alta.
3) A capacidade depende das condições de carregamento, mas menos do que para moléculas pequenas.
a) Os peptídeos são normalmente carregados em condições altamente aquosas, geralmente com a adição de TFA. A capacidade de carregamento de volume sob essas condições é praticamente ilimitada. A capacidade é limitada pela solubilidade durante a eluição.
b) Peptídeos secos podem ser umedecidos com solventes, como DMF ou DMSO. Eles são frequentemente diluídos com água contendo TFA, conforme descrito acima.
c) Em alguns casos, os peptídeos serão dissolvidos em DMF ou DMSO e injetados nessa solução. As diretrizes de volume no gráfico se aplicam a essa condição.
4) Volumes de injeção razoáveis são baseados no diâmetro da coluna a um comprimento de 50 mm com solventes relativamente fortes. O comprimento aumentado é compatível com um volume de injeção maior, mas não proporcionalmente. Solventes mais fracos aumentam significativamente o volume de injeção.
5) Taxas de fluxo razoáveis são baseadas no diâmetro da coluna. Os sistemas serão limitados pelo aumento da contrapressão com o aumento do comprimento e diminuição do tamanho das partículas. Alguns usuários preferem executar peptídeos mais lentamente do que moléculas pequenas, então utilizariam metade da taxa de fluxo sugerida, mas com o dobro da duração do gradiente.

A adequação da Coluna BEH C₁₈ XBridge para peptídeos com 130 Å como a coluna de preferência para isolamentos de peptídeos padrão foi definida pelos resultados obtidos após o teste de um painel de quatro peptídeos com propriedades diferentes. As sequências de peptídeos são proprietárias, mas as propriedades notáveis de cada peptídeo estão listadas na Tabela 2.

Tabela 2. Propriedades do painel de teste de peptídeos.

Os peptídeos são anfipróticos, devido à presença de grupos funcionais fracamente ácidos (ácido carboxílico) e fracamente básicos (amino). Como os peptídeos têm cargas positivas e negativas, eles são chamados de dipolares. Se um peptídeo é submetido a um campo elétrico quando dissolvido em uma solução com uma concentração específica de íons de hidrogênio e não migra, essa concentração de íons de hidrogênio é o ponto isoelétrico (pI) para o peptídeo. Portanto, para simplificar, o ponto isoelétrico (pI) é o pH no qual o peptídeo tem carga líquida zero.

Conforme descrito por Browne, Bennet e Solomon, o índice de HPLC prevê a porcentagem de acetonitrila necessária para eluir o peptídeo a partir de uma coluna C₁₈ µBondapak utilizando TFA:água:acetonitrila como sistema tampão. Eles isolaram peptídeos de matrizes biológicas e previram o perfil de eluição com base na composição de aminoácidos. Valores altos de índice de HPLC, portanto, sugerem maior hidrofobicidade em uma coluna C₁₈. Os valores mudarão, obviamente, com diferentes colunas e fases móveis, mas este sistema simples fornece algumas informações preditivas sobre a natureza dos peptídeos.

Os perfis cromatográficos dos quatro peptídeos no painel de teste, sob condições muito comuns, 0,1% de ácido fórmico em água e em acetonitrila com um gradiente de 5 a 50% B em 50 minutos, são mostrados na Figura 8. Todos os quatro peptídeos modelo mostram cromatografia perfeitamente aceitável com picos simétricos mais finos.

É importante considerar se haveria alguma melhora cromatográfica para os peptídeos grandes ou hidrofóbicos utilizando uma coluna de tamanho de poro de 300 Å. O maior peptídeo no painel de teste de peptídeos, com 39 resíduos e um peso molecular acima de 4000 Da, mostra pouca melhora no formato do pico com o material de retenção de tamanho de poro maior (Figura 9). O peptídeo elui um pouco mais cedo, com a diferença sendo equivalente a cerca de 1 a 2% de acetonitrila. Haverá algum limite de tamanho na utilização do material de retenção com tamanho de poro de 130 Å. É mais provável que esteja acima de aproximadamente 40 resíduos.

O peptídeo hidrofóbico, com um índice de HPLC de 113, também elui como um pico simétrico mais fino nos preenchimentos de 130 Å e 300 Å (Figura 10). A conformação do peptídeo, a forma como o peptídeo é dobrado em solução, também pode influenciar a melhor escolha do tamanho dos poros para uma separação específica. Assim como não há regras rígidas e rápidas para a capacidade de carregamento de peptídeos, as propriedades individuais dos peptídeos também desempenham um papel na decisão do melhor tamanho de poro a ser utilizado. A partir dos experimentos abordados anteriormente, pode-se sugerir que as Colunas BEH XBridge para peptídeos, com fase ligada de C₁₈ e área de poros de 130 Å são uma escolha razoável como ponto de partida para o isolamento de peptídeos.

Do ponto de vista da economia e da eficiência na realização do isolamento de peptídeos em maior escala, é importante considerar o tamanho da partícula. O peptídeo básico, executado em três colunas de tamanho de partícula diferentes, ilustra a consistência da separação (Figura 11). Embora os picos sejam mais largos e menos bem resolvidos com o tamanho de partícula maior, para os preenchimentos de coluna BEH escaláveis, a seletividade química permanece inalterada independentemente de o tamanho da partícula ser de 3,5, 5 ou 10 µm. Os isolamentos em grande escala se beneficiam do tamanho de partícula maior, permitindo taxas de fluxo mais rápidas em colunas de diâmetro cada vez maiores com limites de pressão gerenciáveis, os quais melhoram a capacidade de carregamento, reduzem o número de corridas cromatográficas e economizam tempo e recursos.

Embora os peptídeos tenham propriedades únicas que influenciam o sucesso de seu isolamento de misturas brutas, os princípios básicos da cromatografia de preparação ainda se aplicam. Embora o protocolo de isolamento de peptídeos padrão com um gradiente genérico (como 5 a 50% B ou 5 a 95% B) em uma coluna de fase reversa possa ser utilizado na maior parte do tempo, peptídeos com propriedades exclusivas, às vezes, precisam de desenvolvimento de métodos de separação para obter requisitos de rendimento, pureza ou carregamento. Os métodos de separação geralmente podem ser melhorados alterando o solvente de fase móvel, o modificador, a inclinação do gradiente, a temperatura, o pH ou o método de introdução da amostra. Cada um desses fatores afeta a separação, a qualidade da cromatografia e o sucesso final do isolamento.

Função do solvente

A fase móvel é composta por três componentes, o solvente fraco, o solvente forte e o modificador. Na cromatografia de fase reversa, o solvente fraco é quase sempre a água. Embora o metanol, o etanol ou o isopropanol possam ser considerados para cumprir a função de solvente forte, a acetonitrila é geralmente o solvente de escolha devido à sua baixa viscosidade, força de solvente um pouco mais alta e sua facilidade de uso no intervalo de detecção de UV de baixo comprimento de onda (185 a 205 nm). A acetonitrila geralmente fornece o melhor formato de pico, é fácil de evaporar e reduz o número de reações colaterais que podem ocorrer durante o isolamento e o processamento. Boa transparência de UV fornece alto sinal-ruído para melhor detecção de pico. No entanto, alguns usuários podem se opor à utilização de acetonitrila se quiserem usar o peptídeo em testes biológicos.

A substituição de um álcool, como o etanol, reduz a toxicidade residual que pode estar associada à acetonitrila. Além das preocupações com a biocompatibilidade, as misturas de propanol ou acetonitrila:propanol geralmente aumentam a solubilidade de peptídeos grandes ou hidrofóbicos e quebram os agregados que, às vezes, se formam em solução. O efeito de 70% de isopropanol:30% de acetonitrila no peptídeo básico é mostrado na Figura 12. A resolução do pico principal é melhorada em relação aos contaminantes de eluição mais próxima e o tempo de retenção é reduzido pela metade. Devido à sua maior viscosidade, normalmente, são necessárias temperaturas de coluna elevadas com fases móveis que contêm álcoois.

Função do modificador de fase móvel

O isolamento de peptídeos utilizando cromatografia de fase reversa requer a adição de um modificador polar à fase móvel, uma vez que os peptídeos têm cargas positivas (terminal amino) e negativas (terminal carboxila) que reduzem a afinidade para a superfície hidrofóbica do material de retenção. Os grupos de proteção da cadeia lateral também podem carregar uma carga, como mostrado na Figura 13. Os modificadores controlam o pH para alterar o grau de ionização das cadeias laterais fracamente ácidas ou básicas. O modificador também pode formar pares de íons com o peptídeo. A separação de uma amostra específica pode ser otimizada pela manipulação desses mecanismos.

O ácido fórmico diminui o pH da fase móvel, protonando, assim, as cadeias laterais ácidas no peptídeo e removendo parte da carga negativa (Figura 14). O número reduzido de cadeias laterais de aminoácidos carregadas aumenta a atração para a superfície hidrofóbica da coluna, o que promove uma melhor separação. Embora a maioria dos silanóis na superfície da coluna também possa ser protonada, os silanóis livres ainda estarão disponíveis para ligação com o peptídeo. Essas interações peptídeo-silanol aparecerão como picos assimétricos no cromatograma.

O ácido trifluoroacético (TFA), o modificador mais frequentemente utilizado, difere no mecanismo de interação com a coluna e a amostra (Figura 15). O pH baixo protona as cadeias laterais de peptídeos ácidos, e o pareamento iônico neutraliza as cadeias laterais básicas, inibindo sua ligação a silanóis livres que causam a assimetria de pico. A combinação de carga reduzida e pareamento iônico aumenta a retenção, exigindo uma concentração maior de solvente orgânico para eluição.

O benefício de utilizar uma coluna que tem a partícula híbrida de pontes de etileno é a eliminação de interações de silanol (Figura 16). O TFA não é mais necessário para reduzir a assimetria do pico porque o preenchimento de base tem menos interações com o peptídeo. Tanto o ácido fórmico (AF) quanto o TFA podem ser utilizados, em vez disso, para alterar a seletividade da separação enquanto mantém um bom formato de pico. A diferença na retenção, bem como a mudança na ordem de eluição, pode ser utilizada para ajustar as condições de purificação, conforme mostrado na Figura 17. O asterisco identifica o mesmo peptídeo contaminante nas duas separações, confirmando a mudança considerável e útil na seletividade.

Função do pH elevado

O aumento do pH também pode ser utilizado para alterar a interação entre o peptídeo e a superfície da coluna híbrida de pontes de etileno. Com tampões como o bicarbonato de amônio, o pH alto deprotona e ioniza as cadeias laterais de peptídeos ácidos (Figura 18). O bicarbonato de amônio também deprotona e neutraliza as cadeias laterais de peptídeos básicos, o que reduz a carga do peptídeo e aumenta sua atração para a superfície da coluna hidrofóbica. As cadeias laterais de peptídeos básicos não se ligam aos poucos silanóis residuais restantes, e a assimetria do pico é reduzida. Além desses benefícios, o bicarbonato de amônio é volátil e relativamente fácil de remover do produto peptídico purificado. Hidróxido de amônio, a 0,1%, também pode ser utilizado para elevar o pH da fase móvel e é prontamente evaporado das frações coletadas.

Os extremos de pH alteram a seletividade das separações (Figuras 19 e 20). O peptídeo ácido (Figura 19) retém melhor no preenchimento de fase reversa em pH baixo porque todas as cargas negativas são neutralizadas, e o peptídeo interage fortemente com a superfície da coluna hidrofóbica. Em pH alto, por outro lado, o peptídeo move-se para um tempo de retenção anterior devido a um maior número de cargas negativas, o que o impede de aderir tão fortemente ao preenchimento da coluna. Para este exemplo, o formato de pico permanece inalterado, mas a alteração na ordem de eluição poderia ser utilizada no desenvolvimento de métodos ou para caracterizar o peptídeo com uma estratégia ortogonal.

O peptídeo básico (Figura 20) exibe o comportamento oposto nos extremos de pH, como esperado. Em pH alto, os resíduos básicos do peptídeo são deprotonados e não ionizados. A forte interação do peptídeo com a coluna requer uma maior porcentagem de fase móvel orgânica para eluí-la da coluna. A mudança na seletividade, com resolução melhorada em pH 10, torna o pH mais alto mais atraente para o objetivo final de isolar peptídeos com pureza aumentada.

Lembrete: embora as fases móveis em pH baixo e alto sejam compatíveis com colunas de tecnologia de partículas híbridas, as condições do método em pH extremos não devem ser utilizadas com preenchimentos de coluna à base de sílica. Um pH excessivamente baixo clivará a fase ligada. Um pH alto destruirá o substrato da coluna de partículas de sílica. Verifique sempre os limites de intervalo de pH sugeridos pelo fabricante para colunas específicas à base de sílica.

Função da temperatura

O controle de temperatura é utilizado com mais frequência em cromatografia para garantir separações reprodutíveis. Em condições de isolamento e purificação, ele é importante por vários outros motivos. Os peptídeos hidrofóbicos que têm solubilidade limitada estão entre as amostras mais difíceis de purificar. O aumento da temperatura da separação aumenta a solubilidade dos peptídeos hidrofóbicos e geralmente melhora o formato do pico cromatográfico. Em última análise, isso melhora a pureza e a recuperação do isolamento, tornando-o mais rápido e eficiente.

Como temperaturas distintas fornecem seletividade cromatográfica diferente, o aquecimento da coluna é uma ferramenta muito conveniente para otimizar a separação de uma amostra específica. Além disso, a viscosidade da fase móvel e a pressão total do sistema são reduzidas com temperatura elevada. A pressão mais baixa do sistema reduz a tensão no sistema, nas conexões e na coluna e, em última análise, aumenta a robustez da operação.

Embora o controle da temperatura na cromatografia analítica seja de rotina, a temperatura raramente é empregada como um parâmetro para manipular a cromatografia na escala preparativa por dois motivos. Em primeiro lugar, colunas de grande diâmetro não podem ser aquecidas uniformemente a partir da parte externa. Em segundo lugar, as separações de taxa de fluxo alta realmente ocorrem na temperatura do solvente que entra. Cobertores elétricos e fornos de coluna, embora sejam satisfatórios para separações em pequena escala, não podem aquecer uniformemente colunas grandes. Gradientes de temperatura se formam no diâmetro e no comprimento da coluna, afetando negativamente a cromatografia.

O aquecimento efetivo da coluna é realizado inserindo um loop de preaquecimento de solvente no cabeçote da coluna e submergindo completamente o loop e a coluna em um banho-maria equilibrado com a temperatura desejada (Figura 21). O fluxo contínuo de solvente através do loop de preaquecimento leva a coluna ao equilíbrio interno, enquanto o banho-maria estabiliza o ambiente externo da coluna. A quantidade de alargamento de faixa atribuída ao loop de preaquecimento do solvente é insignificante porque ele é construído com uma tubulação de diâmetro interno estreito. A amostra de entrada também é focada novamente por adsorção no cabeçote da coluna.

O efeito de utilizar o controle de temperatura para separações de peptídeos é mostrado para dois dos peptídeos do painel de teste, o peptídeo básico (Figura 22) e o peptídeo ácido (Figura 23). Nestes exemplos (destacados em vermelho), os componentes da amostra do peptídeo básico são melhor separados a 60 °C, enquanto os componentes da mistura de peptídeos ácidos em bruto são melhor resolvidos a 40 °C. Essas observações são puramente coincidentes, no entanto, uma vez que prever a temperatura ideal para peptídeos ácidos ou básicos é quase impossível e dependerá das propriedades específicas das sequências individuais.

Alterar o solvente, o modificador de fase móvel, o pH e a temperatura afetam drasticamente as separações de peptídeos e qualquer um desses parâmetros pode ser utilizado sozinho ou em conjunto como ferramentas de desenvolvimento de métodos para otimizar a cromatografia. Uma opção de coluna única preenchida com partículas híbridas estáveis, como a tecnologia de Coluna BEH XBridge para peptídeos, pode simplificar o processo de purificação reduzindo o número de colunas e o tempo de screening necessários para o isolamento do peptídeo. A cromatografia do peptídeo básico na Figura 24 ilustra o impacto que pequenas alterações têm na separação. Para os peptídeos com propriedades exclusivas, outros recheios de coluna podem ser úteis para otimizar sua separação.

Focalização do gradiente

As separações cromatográficas para isolamento e purificação são regidas pelos mesmos princípios físicos e químicos das separações analíticas. Entretanto, em experimentos de preparação, os cientistas isolam compostos em altas cargas de massa, geralmente em colunas grandes, e exigem melhor resolução para aumentar a pureza e a recuperação do produto coletado. Criar um gradiente superficial é uma boa primeira abordagem para melhorar a resolução, mas alterar a inclinação do gradiente para toda a separação pode deixar os picos amplos e aumentar o tempo total de corrida. Os gradientes segmentados e focados diminuem a inclinação do gradiente apenas para a parte da separação que requer o aumento da resolução, sem aumentar o tempo total de corrida (Figuras 25 e 26).

Gradientes lineares progridem de composição orgânica baixa para alta (ou seja, 5 a 50% B ou 5 a 95% B) ao longo de um período de tempo definido e são frequentemente utilizados para screening de amostras. Eles também poderão ser empregados para cromatografia preparativa se houver boa resolução entre os componentes da amostra e o tempo de corrida for razoavelmente curto. Os gradientes segmentados mantêm a mesma inclinação antes e depois da parte mais superficial e focada do método, preservando o perfil cromatográfico para essas partes da separação. A parte mais superficial e focada do cromatograma tem uma inclinação de gradiente diminuída, que efetivamente move as impurezas que eluem de perto para longe do pico de interesse.

Gradientes focados destinam-se apenas ao produto. A força do solvente aumenta rapidamente a partir das baixas concentrações utilizadas para o carregamento da amostra para cerca de 5% abaixo do ponto de eluição esperado para o pico do produto. Em geral, a parte superficial do cromatograma prossegue em cerca de um quinto da inclinação da separação original para cerca de 3% acima da eluição esperada para o pico do produto. Quando a parte superficial do gradiente for concluída, a porcentagem de fase móvel orgânica será rapidamente aumentada para lavar a coluna e remover quaisquer contaminantes restantes. Devido à complexidade das misturas de peptídeos, muitas vezes, a melhor resolução é de cerca de 0,25% a 0,33% de alteração/volume da coluna, uma inclinação um pouco mais superficial do que o típico um quinto da inclinação do gradiente de screening original que é empregada para moléculas pequenas e amostras de peptídeos menos complexas.

O volume do sistema é utilizado no projeto do gradiente focado, bem como no escalonamento básico da escala analítica até a preparativa. O volume do sistema, também chamado de volume de atraso ou volume morto, é definido como o volume do ponto de formação de gradiente até o cabeçote da coluna e inclui todos os componentes do caminho do fluxo de HPLC, cabeçotes de bomba, amortecedores de pulso, misturadores, o loop do injetor e a tubulação. No escalonamento geométrico, em que a inclinação é preservada nas escalas analítica e preparativa, o volume do sistema impõe uma retenção isocrática antes de o gradiente começar. Essa retenção pode ser de vários volumes de coluna em pequena escala ou uma fração de um volume de coluna em grande escala. Uma retenção isocrática programada nas condições iniciais é utilizada para compensar a diferença no volume do sistema entre as escalas analítica e preparativa, garantindo, assim, que o gradiente real comece exatamente ao mesmo tempo.

Utilizando um gradiente em etapas (Tabela 3), em que o solvente da fase móvel A é puro, e o solvente da fase móvel B contém um absorvedor de UV apropriado (ou seja, acetona a 2 mL/L), o volume do sistema pode ser facilmente calculado utilizando o procedimento e os cálculos mostrados nas Figuras 27 e 28.

Tabela 3. Gradientes em etapas para determinação de volume do sistema analítico e preparativo.

Embora seja possível estimar o volume do sistema, o volume da coluna e a porcentagem de solvente forte que elui o peptídeo e, em seguida, criar o gradiente segmentado ou focado a partir dessas estimativas para economizar tempo, é útil determinar o volume do sistema experimentalmente e registrar esses valores para experimentos subsequentes. O volume do sistema permanecerá constante enquanto não houver modificações na tubulação de HPLC e a taxa de fluxo do método for idêntica à taxa de fluxo utilizada para medir o volume do sistema. Uma vez que o volume do sistema é determinado experimentalmente, modificações no sistema (como alterar o tamanho do loop do injetor) são facilmente calculadas e não exigem medição de volume adicional. Uma vez que o volume do sistema é determinado, ele pode ser utilizado em cálculos de gradiente focado.

Projeto do gradiente focado

Gradientes focados são normalmente projetados com base na análise da mistura de amostra bruta, mas o procedimento é idêntico para modificar um gradiente que já foi utilizado em uma corrida preparativa inicial. Utilizando as equações mostradas abaixo, a criação de um gradiente focado é muito simples. Suponha que o gradiente a seguir seja aquele a partir do qual o gradiente focado será projetado: coluna de 4,6 X 100 mm, volume do sistema de 1,0 mL, volume da coluna de 1,097 mL*
Tempo de retenção do pico = 7,76 min

*O volume da coluna pode ser determinado utilizando uma calculadora disponível na web ou utilizando o volume de um cilindro: V = πr2h. Os valores serão um pouco diferentes dependendo do método escolhido, pois algumas calculadoras reduzem o volume de líquido para contabilizar o preenchimento da coluna. Contanto que o mesmo método seja utilizado para todos os cálculos, não haverá impacto na cromatografia.

A Figura 29 mostra o cromatograma do peptídeo sintético bruto analisado com esse gradiente.
Calcule o deslocamento entre o ponto de formação do gradiente e o detector

Deslocamento = Volume do sistema + Volume da coluna

Exemplo:
Deslocamento = 1,0 mL + 1,097 mL
Deslocamento = 2,097 mL
Calcule o tempo até o solvente chegar ao detector
Tempo até chegar ao detector = Deslocamento em mL
Taxa de fluxo em mL/min

Exemplo:
Tempo até chegar ao detector = 2,097 mL / 1,46 mL/min
Tempo até chegar ao detector = 1,43 min

Calcule o tempo em que a concentração de eluição do pico foi formada

Tempo da concentração de eluição =
Tempo de retenção do pico – Tempo até chegar ao detector – Retenção de gradiente

Exemplo:
Tempo da concentração de eluição = 7,76 min – 1,43 min – 0,00 min
Tempo da concentração de eluição = 6,33 min

Calcule a % de eluição do pico

% de concentração de eluição =
Tempo da concentração de eluição/Comprimento do piloto X Alteração do piloto /
Segmento de gradiente + % de gradiente piloto inicial / Segmento de gradiente

Exemplo:
% da concentração de eluição = 6,33 min / 10 min X 45% + 5%
% da concentração de eluição = 33,48%

OBSERVAÇÃO: Para todos os cálculos envolvendo porcentagem, use apenas valores absolutos, ou seja, 45 X 6,33 min, não 0,45 X 6,33.

Calcule a inclinação do gradiente piloto em % de alteração por volume de coluna

Nº de volumes de coluna (CV) =
1 CV X Taxa de fluxo em mL X Tempo do segmento de gradiente X mL min

Exemplo:
Nº de volumes de coluna = 1 CV X 1,46 mL X 10 min / 1,097 mL min
Nº de volumes de coluna = 13,3 CV

Exemplo:
Inclinação do gradiente piloto = % de alteração do gradiente piloto
Inclinação do gradiente piloto = 45% / 13,3 CV = 3,38% / CV

Calcule a inclinação do gradiente focado em % de alteração por volume de coluna. Utilize um quinto da inclinação do gradiente piloto.

Inclinação do gradiente focado em % / CV = 1/5 × Inclinação do gradiente piloto

Exemplo:
Inclinação do gradiente focado = 1 X 3,38% / 5 CV
Inclinação do gradiente focado = 0,67% / CV

Crie um segmento de gradiente focado de 5% abaixo a 3 a 5% acima da porcentagem de eluição estimada. O pico elui a 33,5% de acetonitrila. O gradiente superficial deve ir de 28% a 36% de acetonitrila. Calcule o tempo para o segmento do gradiente focado.

Tempo do segmento do gradiente focado =
% de alteração X Inclinação de gradiente focado X Volume da coluna X Taxa de fluxo em mL

Exemplo:
Tempo do segmento do gradiente focado =
8% X 1 CV / 0,67% X 1,097 mL / 1 CV X 1 min / 1,46 mL
Tempo do segmento do gradiente focado = 9,0 min

Registre o gradiente focado começando nas condições iniciais da corrida do piloto e aumentando rapidamente para 5% abaixo da % de eluição do pico.

O painel superior da Figura 30 mostra o cromatograma do peptídeo bruto analisado utilizando o gradiente focado. As impurezas que eluem estreitamente são melhor resolvidas, mas diminuir a inclinação para cerca de um décimo da inclinação inicial (painel inferior) proporcionou a melhor resolução das impurezas. Este exemplo ilustra claramente o impacto que a redução da inclinação para entre 0,25 a 0,33% de alteração por volume de coluna pode ter na separação de uma mistura complexa de peptídeos. Observe que o tempo de retenção do pico do peptídeo principal ainda é de cerca de 7 minutos, aproximadamente o mesmo tempo que o gradiente de screening original. Portanto, a focalização do gradiente aumentou a resolução sem aumentar o tempo de corrida. Embora o tempo de corrida geral para o gradiente total seja maior, outras técnicas, como o término antecipado da corrida, podem ser utilizadas para acelerar o processo de isolamento em uma escala maior. Em última análise, esse peptídeo foi isolado por meio do escalonamento geométrico do gradiente focado mais superficial.

Introdução das amostras

Não há solvente ou técnica universal para dissolver peptídeos sintéticos porque a composição e a sequência de peptídeos afetam diretamente a solubilidade. As escolhas úteis de solvente incluem água com 0,1 a 2% de ácido trifluoroacético, ácido fórmico ou ácido acético, dimetilsulfóxido, hexafluoroisopropanol, 6 a 12 M de guanidina-HCl, dimetilformamida, 0,1% de hidróxido de amônio ou 10 mM de bicarbonato de amônio. Às vezes, os fabricantes fornecem orientações práticas para a dissolução de diferentes tipos de peptídeos. A dissolução do peptídeo frequentemente resulta em um volume relativamente grande de amostra em solvente forte.

Em sistemas convencionais de cromatografia preparativa (Figura 31), grandes volumes de injeção de diluentes de amostra fortes geralmente distorcem o cromatograma, reduzindo a quantidade de produto que pode ser isolada com êxito. À medida que a carga aumenta, a resolução das impurezas que eluem estreitamente é perdida. A precipitação da amostra devido à presença de fase móvel aquosa em ambos os lados da amostra no loop ou no cabeçote da coluna diminui a robustez do sistema e a vida útil da coluna.

Em separações convencionais, uma amostra introduzida na coluna em DMSO, ou algum outro solvente forte, começa imediatamente a se deslocar para baixo da coluna, carregando as moléculas da amostra com ela (Figura 32). A amostra não é retida até que o solvente forte seja diluído na coluna. Infelizmente, no momento em que as faixas de amostra são retidas na coluna, elas já são largas, migrando uma para a outra no leito da coluna. Quando os componentes da amostra eluem a partir da coluna, as faixas não são distintas, e a pureza de cada componente é fraca.

A diluição na coluna (ACD, At-Column Dilution), uma técnica de injeção alternativa, permite a injeção de grandes volumes de solventes fortes e, ao mesmo tempo, melhora a solubilidade da amostra, o carregamento da coluna e a resolução. Com a ACD, o sistema cromatográfico é conectado de forma que a amostra em solvente forte seja diluída no cabeçote da coluna com fase móvel aquosa (Figura 33). A amostra é misturada e adsorvida muito rapidamente na coluna. A taxa de transferência é tão rápida que a precipitação não pode ocorrer. O solvente forte imediatamente começa a ser lavado da coluna antes do início da eluição da amostra.

Uma vez que o gradiente é iniciado, os componentes da amostra eluem como faixas estreitas, de baixo volume e nitidamente resolvidas (Figura 34).

A resolução melhorada entre os picos dos componentes da amostra permite aumentar o tamanho da amostra e, assim, reduzir o número de injeções necessárias para o isolamento. Na prática, com a diluição na coluna, o carregamento da coluna pode frequentemente ser aumentado de três a cinco vezes (Figura 42). A robustez do sistema é aprimorada com a diluição na coluna, pois a amostra tem capacidade limitada de precipitar no loop ou no cabeçote da coluna. A incidência de desligamentos por alta pressão é reduzida, e a vida útil da coluna é estendida.

Exemplo prático de isolamento de peptídeos

Os princípios da cromatografia de preparação se aplicam a todos os tipos de moléculas, incluindo peptídeos. O exemplo a seguir ilustra uma rotina de trabalho típica para isolar um peptídeo em um ambiente de pesquisa e aplica os fatores para otimização do método apresentados acima. O procedimento pode ser modificado dependendo dos requisitos de processamento do laboratório.

O peptídeo utilizado neste exemplo tinha 17 aminoácidos de comprimento com 3 resíduos básicos, 2 ácidos, 8 não polares e 4 polares. A amostra foi dissolvida em dimetilsulfóxido, com vórtice e sonicação, e depois passada através de um filtro de seringa de GHP Acrodisc de 0,45 µm. A massa monoisotópica do peptídeo era de 1772,9 Da e tinha os seguintes estados de carga:
[M+H]⁺ = 1773,9
[M+2H]²⁺ = 887,5
[M+3H]³⁺ = 592,2
[M+4H]⁴⁺ = 447,2

Perfil de peptídeo bruto

A amostra de peptídeo bruto foi analisada com dois modificadores diferentes (0,1% de ácido fórmico e 0,1% de ácido trifluoroacético) na fase móvel para determinar qual forneceria a melhor separação. Embora a acetonitrila seja utilizada com mais frequência como o componente orgânico da fase móvel, neste exemplo, o isopropanol foi empregado para fins de ilustração. Os resultados são mostrados na Figura 35, onde o modificador de TFA (A e B) produziu um pico de produto mais fino com contaminantes bem resolvidos quando comparado ao ácido fórmico (C e D), todos a 40 °C. A separação também foi avaliada a 25 °C e 60 °C, mas 40 °C mostrou o melhor formato de pico e resolução dos picos do componente da amostra (Figura 36). A temperatura um pouco elevada também reduziu a contrapressão do sistema atribuída ao isopropanol como o componente orgânico da fase móvel.

Focalização do gradiente

Depois que o modificador de fase móvel e a temperatura foram otimizados para a análise do peptídeo bruto, a focalização do gradiente foi utilizada para melhorar a resolução de picos de contaminação que eluem estreitamente. A coluna de 4,6 × 50 mm tinha um volume de 0,698 mL, e o volume do sistema foi medido em 0,77 mL. O método de HPLC utilizado para a análise de peptídeos brutos é mostrado abaixo:

Calcule o deslocamento entre o ponto de formação do gradiente e o detector

Deslocamento = volume do sistema + Volume da coluna

Exemplo:
Deslocamento = 0,77 mL + 0,698 mL
Deslocamento = 1,468 mL

Calcule o tempo até o solvente chegar ao detector

Tempo até chegar ao detector =
Deslocamento em mL / Taxa de fluxo em mL/min

Exemplo:
Tempo até chegar ao detector = 1,468 mL / 1,46 mL/min
Tempo até chegar ao detector = 1,00 min

Calcule o tempo em que a concentração da eluição do pico foi formada

Tempo da concentração de eluição =
Tempo de retenção do pico – Tempo até chegar ao detector – Retenção de gradiente

Exemplo:
Tempo da concentração de eluição = 3,23 min – 1,00 min – 0,50 min
Tempo da concentração de eluição = 1,73 min

Calcule a % de eluição do pico

% da concentração de eluição =
Tempo da concentração de eluição / Comprimento do piloto X Alteração do piloto / Segmento de gradiente +
% de gradiente piloto inicial / Segmento de gradiente

Exemplo:
% da concentração de eluição = 1,73 min X 30% + 0% / 4,78 min
% da concentração de eluição = 10,85%

OBSERVAÇÃO: Para todos os cálculos envolvendo porcentagem, use apenas valores absolutos, ou seja, 30 × 1,73 min, não 0,30 × 1,73.

Calcule a inclinação do gradiente piloto em % de alteração por volume de coluna

Nº de volumes de coluna (CV) =
1 CV X Taxa de fluxo em mL X Tempo do segmento de gradiente X mL min

Exemplo:
Nº de volumes de coluna = 1 CV X 1,46 mL X 4,78 min / 0,698 mL min
Nº de volumes de coluna = 9,99
Inclinação do gradiente piloto = % de alteração do gradiente piloto
Número de volumes de coluna

Exemplo:
Inclinação do gradiente piloto = 30% / 9,99 CV = 3,0% / CV

Calcule a inclinação do gradiente focado em % de alteração por volume de coluna. Utilize um quinto da inclinação do gradiente piloto.

Inclinação do gradiente focado em % / CV =
1/5 X Inclinação do gradiente piloto

Exemplo:
Inclinação do gradiente focado = 1 X 3,0% / 5 CV
Inclinação do gradiente focado = 0,6% / CV


Crie um segmento de gradiente focado de 5% abaixo a 3 a 5% acima da porcentagem de eluição estimada. O pico eluiu a 10,85% de acetonitrila, portanto, o gradiente superficial foi projetado para executar a partir de 5 a 13% de acetonitrila em 6,37 min.

Tempo do segmento de gradiente focado =
% de alteração X Inclinação de gradiente focado X Volume de coluna X Taxa de fluxo em mL

Exemplo:
Tempo do segmento de gradiente focado = 8% / 0,6% X 0,698 mL / 1 CV X 1 min / 1,46 mL
Tempo do segmento de gradiente focado = 6,37 min


Registre o gradiente focado começando nas condições iniciais da corrida do piloto e aumente rapidamente para 5% abaixo da % de eluição do pico.

Quando o gradiente focado foi criado, a separação da amostra de peptídeo bruto foi avaliada (Figura 37A). Um pequeno pico de impureza eluiu imediatamente antes do pico do produto, mas foi quase imperceptível. Com o dobro da carga (Figura 37B, 72 µg), a impureza era mais visível, mas o pico principal ainda era relativamente puro. Quatro vezes a carga original de 36 µg produziu um cromatograma em que a impureza era mais pronunciada e provavelmente reduziria a probabilidade de obtenção de produto puro se essa carga fosse dimensionada geometricamente para a coluna maior para preparação (Figura 37C). Com uma carga de 256 µg na coluna analítica, a impureza coeluiu completamente com o pico principal (Figura 37D).

Escalonamento para preparação

A carga de 72 µg na coluna analítica foi selecionada para escalonamento geométrico para preparação. Essa carga conservadora aumentaria a probabilidade de obter uma quantidade razoável de material puro com menos injeções do que escalonar o menor volume de injeção. A carga de massa é proporcional ao volume da coluna e é determinada utilizando uma Calculadora para Escala Preparativa ou resolvendo para M2 na seguinte equação, onde:

M1 é o carregamento de massa na coluna, e 1 M2 é o carregamento de massa na coluna 2
L1 é o comprimento e d1 é o diâmetro da coluna 1, L2 é o comprimento e d2 é o diâmetro da coluna 2

M2 = M1 X L2 / L1 X d22 / d12
M2 = 72 μg X 100 mm / 50 mm X 19 mm2 / 4,6 mm2

M2 = 72 μg X 36,100 / 1058
M2 = 2456 μg ou 2,4 mg

44,03 mg de peptídeo bruto foram dissolvidos em 5 mL de DMSO e filtrados (concentração de 8,80 mg/mL). O escalonamento geométrico da carga de 72 µg na coluna analítica de 4,6 × 50 mm para a coluna preparativa de 19 × 100 exigiu uma injeção de 2,4 mg, conforme calculado acima. Com uma concentração de peptídeo bruto de 8,80 mg/mL, o volume de injeção foi calculado:

Volume de injeção = 2,4 mg X 1 mL / 8,80 mg/mL
Volume de injeção = 0,272 mL ou 272 μL

O gradiente analítico focado foi escalado para preparação, levando em consideração os volumes do sistema em ambas as escalas (Tabela 4). Embora o volume morto pareça alto para o sistema preparativo, ele inclui um loop de preaquecimento de 5 mL para aquecimento da coluna, bem como um loop de injeção de 2 mL. Considerando essas contribuições para o volume do sistema, os 2,75 mL atribuíveis à tubulação restante do sistema eram bastante razoáveis. O pico do produto foi coletado por tempo (Figura 38).

Tabela 4. Escalonamento de gradiente.

• Coluna: 4,6 × 50 mm Coluna: 19 × 100 mm
• Volume morto do sistema: 0,77 mL Volume morto do sistema: 9,75 mL
• Volume da coluna: 0,698 mL Volume da coluna: 23,804 mL
• Volume morto do sistema (em volumes de coluna): 1,10 Volume morto do sistema (em volumes de coluna): 0,41 Deslocamento de gradiente: 0,66

Análise de fração

O pico do produto peptídico foi coletado em duas frações. Essas duas frações eram muito puras, como mostrado na Figura 39. O pico amplo que eluiu em cerca de 2,25 minutos em cada uma das análises de fração e no branco foi mais provavelmente devido à baixa concentração do modificador de ácido trifluoroacético de pareamento iônico na fase móvel. Os constituintes hidrofóbicos no TFA normalmente se acumulam na coluna e, em seguida, eluem durante o gradiente. O contaminante não veio de nenhum componente do sistema, como do injetor ou da válvula, pois outro branco sem a coluna não mostrava picos no cromatograma (Figura 40).

Diluição na coluna

Mesmo que o peptídeo tenha sido isolado com alta pureza, aumentar a carga de amostra por injeção melhoraria a eficiência do processo e reduziria o número de corridas cromatográficas necessárias para purificar a quantidade necessária de produto para os experimentos subsequentes. Como discutido anteriormente, a diluição na coluna gerencia de forma muito eficaz cargas de amostra mais altas com uma mudança de tubulação simples do sistema (Figura 33).

Embora a taxa de alteração de %B por volume de coluna para o isolamento de peptídeos utilizando a diluição na coluna fosse a mesma que o método usado para a separação convencional em escala geométrica, a tabela de gradiente programado foi modificada para incluir a contribuição do solvente orgânico introduzida pela bomba auxiliar de carregamento de amostras (Tabela 5).

Tabela 5. Comparação de gradiente: métodos convencionais e de diluição na coluna.

Tempo de gradiente: 14,40 a 1,66 = 12,74 min Tempo de gradiente: 16,00 a 3,26 = 12,74 min
Volume de gradiente: 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL Volume de gradiente: 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL
Volumes de coluna: 318,5 mL × 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV Volumes de coluna: 318,5 mL × 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV
Inclinação do gradiente: 8%/13,38 CV = 0,6%/CV Inclinação do gradiente: 8%/13,38 CV = 0,6%/CV
Taxa de fluxo da bomba de carregamento durante o gradiente = 1,25 mL/min
1,25 mL/min = 5% do fluxo total
Taxa de fluxo total do método de gradiente = 25 mL/min

A bomba de diluição na coluna introduz solvente orgânico diretamente no loop de amostras e é programada para funcionar a 5% da taxa de fluxo total. Portanto, a taxa de fluxo na bomba cromatográfica é diminuída de 25 mL/min no método convencional para 23,75 mL/min no método de diluição na coluna. Observe que a taxa de fluxo total ainda é de 25 mL/min (23,75 mL/min + 1,25 mL/min). Como a bomba de diluição na coluna está conectada diretamente ao injetor, uma etapa de retenção na condição inicial, longa o suficiente para garantir a transferência completa da amostra do loop até a coluna, é inserida no início do gradiente. Este sistema está configurado com um loop de 2 mL, e a etapa de retenção original era de 0,66 min.

Cálculo da etapa de retenção para o método de diluição na coluna: loop de 2 mL x (1 min / 1,25 mL) = 1,6 min
Etapa de retenção de 1,60 min + 0,66 min do método de preparação original = etapa de retenção de 2,26 min para o método de diluição na coluna.

As porcentagens do método de gradiente de A e B também são modificadas para refletir a contribuição da bomba de diluição na coluna. O gradiente focado começa em 5%B e prossegue para 13%. Como 5% do fluxo total é fornecido a uma taxa de fluxo constante de 1,25 mL/min de isopropanol pela bomba de diluição na coluna, as porcentagens de B no método de diluição na coluna são programadas como 0% e 8%B, respectivamente. Observe que, embora o método de diluição na coluna seja programado de forma um pouco diferente, o gradiente real é idêntico ao método convencional. Como esse peptídeo elui em uma porcentagem tão baixa de B, o tempo real gasto a 5%B é maior no método de diluição na coluna, incorporando o tempo gasto na alteração de 0%B para 5%B no método de preparação convencional no tempo de retenção no método de diluição na coluna. Essas duas etapas são programadas em linhas separadas no método de diluição na coluna para fins de clareza para o leitor. Como as porcentagens de B são reduzidas para representar os 5%B fornecidos pela bomba de diluição na coluna, as porcentagens de A devem ser aumentadas em 5% para manter o gradiente idêntico ao método de injeção convencional original. Se o sistema cromatográfico tiver etapas de lavagem na sequência de injeção, certifique-se de que todas as linhas de lavagem estejam purgadas e preenchidas com solvente de lavagem forte.

Como o isolamento em grande escala em escalonamento geométrico foi realizado a 40 °C, a temperatura foi mantida para a injeção utilizando a diluição na coluna. O loop de preaquecimento do solvente foi inserido imediatamente antes do T no fluxo de solvente aquoso (Figura 41).

O loop de preaquecimento do solvente, o T e a coluna foram submersos no banho-maria. Antes de iniciar a separação do gradiente, foi permitido que a pressão se estabilizasse, o que significava que o equilíbrio do sistema havia sido alcançado. Embora 2,4 mg de peptídeo fosse a quantidade máxima de amostra que poderia ser injetada utilizando a configuração de tubulação convencional, cinco vezes essa quantidade, ou 12 mg (1,36 mL), foi introduzida na coluna com o sistema na configuração de diluição na coluna (Figuras 42 e 43). As frações foram coletadas por tempo e subsequentemente analisadas utilizando o método de screening original a 0 a 30%B. As frações mostraram pureza excelente e eram comparáveis às frações coletadas da preparação que utilizou a técnica de injeção convencional (Figura 44).

Considerações especiais para peptídeos hidrofóbicos

Um peptídeo hidrofóbico composto por 12 resíduos de aminoácidos não carregados apolares e 3 polares foi dissolvido em dimetilsulfóxido. O gradiente focado preparativo abaixo foi utilizado para isolamento em uma coluna de 19 × 100 mm com o sistema cromatográfico conectado para injeção convencional. A extrema hidrofobicidade do peptídeo exigiu a utilização de uma taxa de fluxo reduzida, carregamento de amostra mais baixo e uma temperatura de 60 °C.

Embora esse peptídeo seja um bom candidato para utilizar a diluição na coluna, aumentar a carga de massa na coluna representa o risco de precipitação. Uma vez que o peptídeo elui a cerca de 50% de acetonitrila, o carregamento dessa amostra a 5%B (como no exemplo anterior) está tão abaixo da força de eluição necessária que o peptídeo está sujeito à precipitação à medida que é diluído no cabeçote da coluna. O aumento da porcentagem de solvente orgânico proveniente da bomba cromatográfica durante a etapa de carregamento alivia o possível problema de precipitação. Geralmente, para compostos extremamente hidrofóbicos, utilizar uma porcentagem inicial de solvente orgânico no método de gradiente que seja de 20 a 25% abaixo da porcentagem de eluição esperada do composto evita a precipitação da amostra, enquanto preserva os benefícios da técnica de diluição na coluna. O gradiente de diluição na coluna modificado abaixo foi utilizado para carregar uma amostra cinco vezes maior na coluna de 19 × 100 mm (Figura 45).

O gradiente começou em 48%B (43,6%B + 5%B da bomba de diluição na coluna) e terminou em 53% de acetonitrila em 29 minutos com uma inclinação de 0,49% de alteração por volume de coluna, idêntica à taxa de alteração do gradiente utilizada para a injeção convencional. A bomba de diluição na coluna carregou a amostra de peptídeo do loop de 5 mL para o T em acetonitrila a 100%, onde encontrou a fase móvel da bomba cromatográfica em sua condição inicial, 23,6%B (18,6%B + 5%B da bomba de diluição na coluna). A retenção de 9,2 minutos no início do método garantiu que a amostra fosse completamente carregada na coluna. A bomba de diluição na coluna funcionou a uma taxa de fluxo constante de 0,8 mL/min, que era 5% da taxa de fluxo total de 16,3 mL/min.

Todas as colunas requerem limpeza ocasionalmente, sejam elas utilizadas para separações de moléculas pequenas ou grandes. Alta contrapressão, alto background cromatográfico e picos estranhos que não podem ser atribuídos à amostra são indicações de que a coluna precisa de limpeza.

Evitar o acúmulo de contaminantes na coluna é a melhor maneira de estender sua vida útil. É recomendado filtrar todas as amostras antes da injeção. Adicionar um filtro em linha antes da coluna ou adicionar uma pré-coluna ajuda a reter particulados e outros componentes indesejáveis da mistura. Lavar a coluna com dois a três volumes de coluna de uma alta porcentagem de solvente orgânico após cada separação é útil para remover sistematicamente contaminantes indesejados. Por fim, a diluição na coluna mantém as amostras em solução, evitando o desligamento por alta pressão e passando efetivamente os componentes da amostra pelo sistema de purificação, independentemente de seu destino final ser um tubo de coleta de frações ou a lata de resíduos.

A contrapressão alta que ocorre repentinamente é mais provável devido à precipitação da amostra em algum lugar no sistema — no loop de amostras, na tubulação, na coluna ou na célula de fluxo do detector. Com o bombeamento do sistema cromatográfico, afrouxar metodicamente as conexões de HPLC, começando na linha de descarte e voltar para as bombas, isolará definitivamente a fonte de alta pressão. Um aumento gradual na contrapressão é provavelmente resultado do acúmulo de impurezas na coluna após várias injeções e pode ser retificado de várias maneiras diferentes. A execução de gradientes rápidos repetitivos a uma temperatura elevada, a lavagem da coluna por um tempo prolongado em uma alta porcentagem de solvente orgânico ou a injeção de um "solvente de limpeza", como DMSO ou 1 a 10% de ácido fórmico, podem ser utilizados para remover contaminantes indesejáveis da coluna (Figura 46).

A despirogenação, a remoção de polissacarídeos endotóxicos da coluna que podem contaminar o produto final e induzir uma reação alérgica, geralmente requer lavagem forte com hidróxido de sódio a 1 M por uma hora ou mais. Esse procedimento é incompatível com as colunas atuais.