Abordagens práticas para o isolamento de peptídeos

Embora o isolamento tradicional de peptídeos seja geralmente realizado utilizando detecção UV, o isolamento direcionado por massa torna o processo de purificação mais fácil com menos discriminação ambígua entre o peptídeo de destino e os contaminantes formados durante a síntese e a clivagem. A detecção de massas pode ser utilizada para avaliar a identidade e homogeneidade do pico em cromatogramas complexos e aumentar o rendimento da amostra. O desenvolvimento de uma separação que englobe a detecção de massas e UV garante um perfil cromatográfico de amostra mais completo. Os compostos que não ionizam, ou ionizam mal, geralmente são detectados com UV de baixo comprimento de onda. Por outro lado, os peptídeos com atenuação de UV muito baixa, de modo geral, serão detectados prontamente com MS.

Solventes

Os solventes normalmente utilizados no isolamento de peptídeos, incluindo acetonitrila, metanol, etanol e isopropanol, são todos compatíveis com electrospray (ESI) e outras técnicas de ionização atmosférica. No entanto, a acetonitrila geralmente fornece a melhor resolução, seletividade, simetria de pico e eficiência. A viscosidade mais baixa da acetonitrila também reduz a contrapressão do sistema LC quando utilizada para isolamentos cromatográficos. A volatilidade, bem como a capacidade do solvente de doar prótons, são importantes para o ESI. Os solventes orgânicos voláteis reduzem a tensão superficial das gotículas formadas na fonte de MS, o que proporciona melhor ionização e aumento da sensibilidade. Muitos peptídeos são analisados e isolados utilizando modificadores ácidos, como o ácido fórmico ou o ácido trifluoroacético, embora o TFA suprima a ionização até certo ponto. Se a comutação positiva-negativa for necessária para o desenvolvimento de métodos, as fases móveis de acetato de amônio ou formiato de amônio serão escolhas compatíveis e aceitáveis para a MS. Para peptídeos melhor separados em pH alto, as fases móveis feitas com bicarbonato de amônio são adequadas. Para reduzir a possibilidade de precipitação no detector de massas, tampões voláteis devem ser utilizados em concentrações de 20 mM ou menos.

Gerenciamento da detecção

Considerações especiais devem ser dadas à detecção em cromatografia preparativa. Os picos altamente concentrados excedem o intervalo linear da maioria dos detectores, e as taxas de fluxo altas não são compatíveis com o hardware do detector. Alguns detectores, como MS e ELSD, são destrutivos. Portanto, é necessário reduzir efetivamente o fluxo e a concentração que chegam aos detectores, minimizando a perda de amostra. Um divisor de fluxo passivo é comumente utilizado para dividir e diluir a amostra antes que ela chegue aos detectores (Figuras 47 e 48). Um solvente complementar dilui a amostra do fluxo de preparação e a transfere para os detectores.

Os divisores passivos são fabricados para serem utilizados com um intervalo de taxa de fluxo cromatográfico e uma razão de separação específicos. Os fluidos do divisor devem corresponder à taxa de fluxo apropriada para a coluna selecionada. Razões de separação mais altas são utilizadas onde os picos eluem em concentração mais alta. Divisores de fluxo comumente utilizados e suas razões de separação são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6. Divisores passivos disponíveis na Waters.

Como alternativa à divisão de fluxo passiva, um divisor ativo faz a amostragem mecânica do fluxo de preparação a uma taxa compatível com a razão de separação programada. O fluxo amostrado é então diluído e carregado para os detectores pelo solvente complementar. No entanto, os divisores ativos frequentemente perturbam a linha de base e, além disso, o desgaste mecânico frequentemente compromete o desempenho. Tanto os divisores de fluxo passivos quanto os ativos são igualmente eficazes na amostragem do fluxo de preparação, de modo que o tipo de divisor empregado depende da preferência do usuário.

Modificadores

Fases móveis e modificadores específicos são escolhidos com base na utilização pretendida do peptídeo sendo isolado. Como discutido anteriormente, o modificador de fase móvel é um aditivo que controla o caráter iônico do peptídeo aumentando ou diminuindo o pH. Também pode aumentar a hidrofobicidade da amostra por meio da formação de pares de íons com as cadeias laterais carregadas do peptídeo e seus terminais. O ácido trifluoroacético é frequentemente utilizado para essa finalidade.

O pareamento iônico aumenta a interação do peptídeo com a fase estacionária da coluna hidrofóbica e, consequentemente, a qualidade da separação geralmente melhora. Infelizmente, os pares de íons fortes formados com TFA não podem ser separados facilmente com as condições utilizadas na ionização por electrospray. Como resultado, menos moléculas de peptídeos são ionizadas, e a intensidade do sinal é reduzida. De preferência, o modificador mais adequado seria aquele que formasse pares de íons para melhorar a separação cromatográfica, mas não impediria a ionização por electrospray.

Apffel, et al. propuseram a adição de pós-coluna de um ácido fraco que competiria com o TFA para emparelhar com o analito. Com um ácido fraco em uma concentração alta o suficiente para conduzir a competição para favorecer a protonação do TFA, o TFA protonado pode ser evaporado, e o analito pode ionizar-se com mais eficiência. A sensibilidade e a intensidade do sinal de MS são aumentadas. Embora muitos ácidos diferentes em concentrações distintas possam ser utilizados para essa finalidade, o ácido propiônico a 0,1% em água/orgânico na proporção de 1:1 como solvente complementar na purificação direcionada por massa tem sido empregado com sucesso.

Massa monoisotópica versus Massa média

Embora a purificação direcionada por massa reduza a ambiguidade no isolamento de destinos peptídicos, é importante considerar quais massas devem ser utilizadas para o acionamento da fração. Para a maioria dos isolamentos de moléculas pequenas, a massa monoisotópica é a massa principal utilizada para identificação, enquanto outros adutos de íons relacionados são definidos e monitorados com base nesse valor. Para moléculas maiores, como peptídeos, às vezes, a massa média é utilizada como o identificador principal.

A massa monoisotópica é calculada utilizando a massa dos isótopos mais abundantes de cada elemento na molécula, enquanto a massa média é calculada utilizando a média ponderada de todos os isótopos de ocorrência natural de cada elemento na molécula. Consequentemente, para peptídeos, a massa média pode ser notavelmente maior do que a massa monoisotópica. À medida que o número de carbonos na molécula aumenta, há uma probabilidade maior de que mais 13_C esteja presente, o que, por sua vez, aumenta o peso molecular.

Além disso, a massa monoisotópica pode não ser o pico mais abundante no espectro de massas. Embora não haja uma regra para definir quando utilizar a massa monoisotópica ou a massa média, o intervalo de peso molecular de 1500 a 1700 é geralmente o ponto de cruzamento para a transição para utilizar a massa média para o acionamento de peptídeos. Na prática, muitos programas de software disponíveis calculam a média e a m/z monoisotópica para os estados de carga do peptídeo. É mais prudente incluir ambas as alternativas como gatilhos. As melhores escolhas para o acionamento se tornarão evidentes durante a corrida de screening antes do isolamento.

Estados de carga

O electrospray, uma técnica que ioniza amostras em condições suaves e gera moléculas com várias cargas, é frequentemente utilizada na purificação direcionada por massa. Embora alguns peptídeos possam ter pesos moleculares mais altos do que o limite de massa superior do analisador, íons com carga múltipla e valores de m/z mais baixos normalmente estão dentro da faixa de massa do espectrômetro. Vários fatores influenciam os estados de carga dos peptídeos, incluindo o pH da solução, o número de grupos funcionais ácidos e básicos e as propriedades físicas do solvente utilizado na análise.

Como discutido anteriormente, o processo de isolamento de peptídeos geralmente começa com análise. O peso molecular e os possíveis estados de carga são calculados, garantindo uma identificação mais fácil do produto peptídico. Embora o perfil da amostra bruta revele a extensão do desenvolvimento de métodos necessário para melhorar a resolução que levará ao isolamento do produto puro, a análise também revela informações sobre os estados de carga. Considere o espectro de massas derivado do cromatograma de íons totais analítico bruto mostrado na Figura 49. A massa do peptídeo calculada foi de 1772,9, e o íon carregado positivamente (1773,9) está presente, embora em uma quantidade muito pequena. O íon duplamente carregado em 887,8 é, de longe, o íon presente em maior abundância. Uma pequena quantidade de íon triplamente carregado (592,3) e uma impureza (781,2) também estão presentes em quantidades menores. Apesar da presença de íons com carga múltipla no espectro de massas, o peptídeo é revelado como um único pico no cromatograma. Previsivelmente, os picos com carga dupla e tripla eluem ao mesmo tempo nos cromatogramas de íons extraídos (Figura 50).

Acionadores de coleta de frações

Muitas vezes, a carga múltipla dos peptídeos dificulta prever as espécies mais abundantes em um determinado experimento de MS. Portanto, os gatilhos de fração para o isolamento de peptídeos utilizando a purificação direcionada por massa devem incluir todos os íons com carga múltipla esperados.

Coleta de dados: contínuos versus de centroide

Devido à complexidade das amostras de peptídeos, à probabilidade de vários estados de carga e às alternativas para utilizar a massa monoisotópica ou média conforme o comprimento do peptídeo aumenta, os dados de MS devem ser coletados no modo contínuo. Dados contínuos mostram a intensidade observada de todos os pontos resolvidos no eixo de massa. Inclui a imprecisão estatística na medição da m/z de uma intensidade específica. Esse sinal bruto pode então ser processado para produzir a intensidade de cada um dos possíveis sinais de massa sobrepostos. Isso permite a discriminação de m/zs muito semelhantes. Os dados de centroide são dados contínuos processados para exibir um único ponto de dados centralizado para cada distribuição de íons em um espectro de massas e são exibidos como varetas no espectro de massas. (Figura 51).

Exemplos de isolamento de peptídeos direcionado por massa

Os dois peptídeos a seguir, fornecidos pela Dr. Kelly Wasmund da Research Genetics, Inc. (Huntsville, AL, EUA), foram isolados por purificação direcionada por massa utilizando os princípios discutidos:

• NH2-ISQAVHAAHAEINEAGR-COOH (abreviado como ISQA)
• NH2-SIINFEKL-COOH (abreviado como SIIN)

Cada peptídeo foi umedecido individualmente em 0,5 mL de dimetilformamida (DMF) e, depois, diluído para 5,0 mL com água. A concentração de ISQA foi estimada em 5 a 10 mg/mL, e o SIIN foi estimado em 10 mg/mL. As condições para as separações em pequena escala de cada um dos peptídeos são fornecidas na Tabela 7; os resultados cromatográficos e espectrais são apresentados nas Figuras 52 e 53, respectivamente. Os íons de destino calculados para os vários estados de carga de ISQA e SIIN são mostrados na Tabela 8.

Pequena escala
Solvente A: 0,1% de TFA em água
Solvente B: TFA a 0,1% em acetonitrila
Volume de injeção: 40 µL
Coluna: 4,6 × 50 mm Symmetry 300, C₁₈, 5 µm

Grande escala
Solvente A: 0,1% de TFA em água Solvente B: TFA a 0,1% em acetonitrila
Volume de injeção: 5 mL
Coluna: 30 × 150 mm Symmetry 300, C₁₈, 7 µm
Massas de destino: (ISQA) [M+H]+ = 1773,9, [M+2H]2+ = 887,5, [M+3H]3+ = 592,2, [M+4H]4+ = 447,2
Massas de destino: (SIIN) [M+H]+ = 963,5, [M+2H]2+ = 482,3, [M+3H]3+ = 321,9

Tabela 7. Condições de gradiente utilizadas nas separações de pequena escala de ISQA e SIIN.

Tabela 8. Íons de destino calculados para os vários estados de carga de ISQA e SIIN.

Noções básicas das curvas de van Deemter

Gradientes focados para cada um dos peptídeos foram projetados para melhorar a resolução entre o peptídeo de destino e seus contaminantes de eluição próxima. O gradiente focado preparativo para ISQA começou em 12%B e foi executado para 20%B, com o peptídeo eluindo perto de 17%B (Tabela 9 e Figura 54). Da mesma forma, o gradiente focado preparativo para SIIN foi executado de 23% a 31%B, com o produto eluindo perto de 28%B (Tabela 10 e Figura 55). Os gatilhos de massa para coleta de frações incluíram os íons com carga múltipla esperados (Tabela 8).

Noções básicas das curvas de van Deemter

Tabela 9. Gradiente de preparação focado utilizado para a purificação de ISQA.

Tabela 10. Gradiente de preparação focado utilizado para a purificação de SIIN.

As frações resultantes das corridas preparativas foram analisadas para avaliar a pureza. Vários canais de detecção foram utilizados para monitorar a análise para fornecer caracterização completa das frações. A análise da fração de ambos os peptídeos ISQA e SIIN foi executada com o mesmo método de gradiente utilizado para a análise de peptídeos brutos. Os resultados são mostrados para ISQA e SIIN nas Figuras 56 e 57, respectivamente.

Conclusão

Os peptídeos continuam a preencher um nicho importante no campo da terapêutica com tecnologias novas e aprimoradas para síntese, projeto, descoberta, desenvolvimento e fabricação de medicamentos. Apesar das mudanças na tecnologia, os princípios fundamentais do isolamento de peptídeos permanecem constantes com muitos processos que dependem de HPLC de fase reversa associada à detecção UV e de massas. Analisar o peptídeo bruto utilizando um gradiente rápido, focalizar o gradiente e escalonar geometricamente para uma coluna maior com diluição na coluna e controle de temperatura são meios eficazes para isolar rapidamente os peptídeos de destino. Embora a detecção UV seja amplamente utilizada no isolamento de peptídeos, a purificação direcionada por massa reduz o número de frações coletadas e o tempo necessário para a análise da fração subsequente. Gerenciar o sinal do detector utilizando tecnologia de divisão e diluição, empregando fases móveis cromatográficas, modificadores e solventes complementares adequados, e selecionar estados de carga razoáveis para o acionamento de fração simplificam o protocolo de purificação de peptídeos.