Abordagens práticas para o isolamento de peptídeos

Divisor ativo

Dispositivo que é utilizado para gerenciar o sinal do detector de Espectrometria de Massas por meio da amostragem do fluxo preparativo com uma razão de separação definida, conforme programado pelo usuário. A amostra é diluída e transferida para os detectores com um solvente complementar.

Diluição na coluna

Técnica de injeção exclusiva que aumenta a capacidade de massa, melhora a resolução, aumenta a vida útil da coluna e melhora a robustez do sistema LC diluindo a amostra em solvente forte no cabeçote da coluna.

Massa média

 Massa de um íon ou molécula ponderada para sua composição isotópica.

Centroide

Dados contínuos processados para exibir um único ponto de dados centralizado para cada distribuição de íons em um espectro de massas e são exibidos como varetas no espectro de massas.

Estado de carga

Os espectrômetros de massas operam com base na relação massa/carga (m/z), em que z é definido como o estado de carga. Calculado dividindo 1 Da, a diferença de massa teórica entre os isótopos, pela diferença de massa real da molécula entre os isótopos.
carga única m/z = (M+H)/1
carga dupla m/z = (M+2H)/2
carga n m/z = (M+nH)/n
Os picos de isótopos de íons carregados n são separados por 1/n Da (por exemplo, os picos de isótopos de íons duplamente carregados são separados por 0,5 Da). O carregamento múltiplo estende a faixa de massa do espectrômetro de massas.

Cromóforo

Grupo molecular que absorve luz em uma frequência específica.

Volume da coluna

Volume dentro do corpo da coluna.

Dados contínuos

Perfil completo da distribuição de todos os sinais presentes em um espectro de massas.

Clivagem

A remoção do peptídeo da resina na síntese de peptídeos em fase sólida.

Volume de atraso

O volume do ponto de mistura do gradiente até o cabeçote da coluna em um sistema cromatográfico.

Desproteção

A remoção de grupos de proteção da cadeia lateral de aminoácidos. Também a remoção de grupos de proteção de peptídeos N-terminais na síntese de peptídeos em fase sólida.

Volume morto

O mesmo que o volume do sistema.

Electrospray

Técnica de ionização atmosférica que produz muito pouca fragmentação e é útil para analisar biomoléculas e compostos polares.

Gradiente focado

Gradientes que têm como alvo apenas o produto aumentando rapidamente a força do solvente das baixas concentrações utilizadas para o carregamento da amostra para cerca de 5% abaixo do ponto de eluição esperado para o pico do produto. Para peptídeos, o segmento superficial do gradiente é melhor executado em aproximadamente 0,25 a 0,33% de alteração por volume de coluna. Uma vez que o produto peptídico é eluído, a coluna é lavada com uma alta porcentagem de solvente orgânico e, em seguida, reequilibrada nas condições iniciais.

Índice de HPLC

Prevê a porcentagem de acetonitrila necessária para eluir o peptídeo de uma Coluna C₁₈ µBondapak utilizando TFA:água:acetonitrila como sistema tampão, conforme descrito por Browne, Bennet e Solomon.

Hidrofóbico

Tende a não se dissolver, não se misturar ou não ser umedecido por água.

Cromatografia de troca iônica

Separação de compostos utilizando colunas com funcionalidade carregada ligadas à sua superfície.

Ionização

Processo pelo qual uma molécula obtém uma carga elétrica ganhando ou perdendo elétrons.

Isocrático

Cromatografia em que a composição da fase móvel permanece constante ao longo da separação.

Gradiente linear

Método de separação que altera a composição da fase móvel ao longo de um período de tempo definido.

Carregamento

Quantidade de composto que pode ser aplicada a uma coluna de dimensões específicas.

Solvente complementar

Solvente utilizado para diluir e transferir a amostra dividida do fluxo de preparação para os detectores em um sistema de purificação direcionado à massa.

Capacidade de massa

Carga em massa; diretamente proporcional ao volume da coluna.

Fase móvel

Solventes utilizados para eluir compostos de uma coluna.

Modificador de fase móvel

Aditivos misturados aos solventes cromatográficos para melhorar a separação.

Massa monoisotópica

Massa calculada utilizando os isótopos mais abundantes de cada elemento na molécula.

Divisor passivo

Dispositivo utilizado para fazer a amostragem contínua do fluxo de preparação com uma razão de separação definida; gerencia o sinal do detector na purificação direcionada por massa.

Resolução

A largura de dois picos em relação à distância entre esses picos.

Cromatografia de fase reversa

Um tipo de método de separação em que a fase móvel é mais polar que o material de retenção. Os compostos são separados com base em sua interação com a fase estacionária não polar.

Escalonamento

Manter uma separação na transferência de uma coluna pequena para uma coluna grande ou vice-versa.

Gradiente segmentado

Método de separação que mantém a inclinação antes e depois de uma porção superficial e focada do gradiente, preservando, assim, o perfil cromatográfico para essas partes da separação.

Gradiente superficial

Método de separação em que a taxa de alteração da concentração de solvente orgânico por volume de coluna é baixa.

Grupo de proteção da cadeia lateral

Moléculas orgânicas ligadas às cadeias laterais de aminoácidos para evitar que as cadeias laterais reajam com outras moléculas durante a síntese de peptídeos.

Silanol

Grupo químico localizado no material de retenção da coluna de substrato de sílica que está disponível para interação com a amostra.

Cromatografia de exclusão por tamanho

Separação de compostos com base em seu tamanho na solução.

Inclinação

A taxa de alteração na composição do solvente orgânico por volume de coluna durante uma separação de gradiente.

Síntese de peptídeos em fase sólida

Processo pelo qual um peptídeo é construído adicionando sequencialmente aminoácidos a uma cadeia em crescimento com o primeiro aminoácido C-terminal ligado a um suporte sólido.

Síntese de peptídeos em fase de solução

Processo pelo qual os peptídeos são sintetizados em solução com reações sintéticas orgânicas. Segmentos de peptídeos curtos podem ser condensados juntos para formar sequências longas de peptídeos.

Razão de separação

A quantidade de material continuamente "removido" e diluído do fluxo de amostra antes da transferência para os detectores durante a purificação direcionada por massa.

Volume do sistema

O mesmo que o volume morto e o volume de atraso.