Abordagens práticas para o isolamento de peptídeos
Introdução
Os peptídeos desempenham um papel único no desenvolvimento de novos candidatos a medicamentos e preenchem um nicho especializado entre as terapias de moléculas pequenas tradicionais e as de proteínas maiores. Com maior eficácia, segurança e tolerabilidade em humanos em comparação com moléculas pequenas, e com menor complexidade e custo de produção do que biofármacos à base de proteína, os peptídeos são cada vez mais atraentes como potenciais candidatos a medicamentos visando muitas condições médicas. Os peptídeos sintéticos podem ser utilizados para estudar as relações estrutura-atividade entre substratos celulares ou serem eficazes como medicamentos em si. Independentemente de os peptídeos serem feitos em etapas utilizando a síntese de peptídeos em fase sólida, a síntese em fase de solução ou isolados de fontes de ocorrência natural, quase todas as misturas de peptídeos em bruto são complexas e requerem purificação. Mesmo que as reações de síntese sejam cuidadosamente controladas, as impurezas são formadas inevitavelmente e podem incluir exclusões, truncamentos ou sequências modificadas quimicamente, incluindo adutos de clivagem ou outros subprodutos formados durante o processamento.
Os avanços tecnológicos na metodologia analítica feitos nos últimos anos também influenciaram a prevalência de peptídeos como diagnósticos e novas terapêuticas. Os métodos analíticos executados em equipamentos de última geração mostram uma sensibilidade aprimorada e uma resolução mais alta em um período de tempo mais curto, o que leva a uma economia de tempo crítica durante a produção.
Os peptídeos sintéticos oferecem desafios únicos no desenvolvimento de um método de isolamento. Para estudos futuros, a pureza e o rendimento de peptídeos de destino são fatores críticos que influenciam os resultados experimentais. Como mencionado acima, o número de impurezas resultantes da síntese, clivagem e desproteção de um peptídeo sintético pode ser muito grande. O isolamento do produto peptídico pode ser melhorado aplicando princípios de desenvolvimento de método que são frequentemente associados à HPLC analítica. Os mecanismos de separação utilizados para criar um método de purificação em uma escala preparativa maior são os mesmos que os princípios utilizados em uma escala menor. A seleção da coluna, a escolha do modificador de fase móvel, a utilização da temperatura e a otimização do gradiente são escolhas que devem ser examinadas no desenvolvimento de qualquer método de separação. O desenvolvimento sistemático de métodos para isolamentos de peptídeos pode melhorar significativamente a pureza e o rendimento do produto. Embora o isolamento de peptídeos tradicional seja normalmente realizado utilizando cromatografia direcionada por UV, a utilização de isolamento direcionado por massa juntamente com o desenvolvimento prudente de métodos torna o processo de purificação mais fácil com uma melhor discriminação entre o peptídeo de destino e os contaminantes formados durante a síntese e a clivagem.
Requisitos do processo de purificação de peptídeos
O objetivo de qualquer estratégia de isolamento é purificar o máximo de amostra no menor tempo possível, com a pureza necessária para realizar experimentos subsequentes. Para o laboratório normal que sintetiza muitos peptídeos diferentes, é útil estabelecer um protocolo de purificação padrão que possa ser utilizado para a maioria das amostras, permitindo uma otimização simples quando necessário. As alterações na composição da fase móvel, no modificador ou na temperatura em colunas com desempenho consistente entre corridas eliminam a necessidade de ter vários conjuntos de colunas para isolamento. Essas opções econômicas para melhorar o rendimento e a pureza são diretas e fáceis de implementar. O processo ideal de purificação de peptídeos também utiliza equipamentos robustos, capazes de executar isolamentos em uma variedade de escalas analíticas e preparativas. A simples alteração da coluna para o diâmetro de coluna com tamanho adequado para realizar o isolamento em um equipamento versátil com ampla faixa de taxa de fluxo torna a purificação eficiente. Todos esses fatores, considerados em conjunto, podem reduzir os custos gerais associados à purificação de peptídeos.
Rotina de trabalho de isolamento de peptídeos
Um protocolo de isolamento de peptídeos padrão (Figura 1) começa com a definição de quanto peptídeo puro é necessário para realizar os experimentos subsequentes. A análise do peptídeo bruto fornece uma estimativa razoável da pureza da amostra e, combinada com a quantidade definida de peptídeo puro necessária para estudos posteriores, a carga de massa estimada pode ser calculada. A carga de massa define o tamanho da coluna preparativa e, por sua vez, a taxa de fluxo necessária no equipamento de LC selecionado.
Figura 1. Rotina de trabalho de isolamento de peptídeos.
O escalonamento geométrico para uma grande coluna do mesmo recheio para realizar o isolamento segue a análise de peptídeos brutos. As equações de escalonamento na Figura 2 mostram as relações entre o diâmetro e o comprimento da coluna, o carregamento de massa e a taxa de fluxo para mover uma separação de um tamanho de coluna para outro. Expressar a inclinação do gradiente como % de alteração por volume de coluna, em vez de % de alteração por unidade de tempo, ajuda a garantir que a resolução seja preservada fornecendo o mesmo número de volumes de coluna para cada etapa do método de gradiente, das condições iniciais às finais. Os métodos preparativos devem incluir uma retenção inicial nas condições de início para simular o atraso do sistema, também expresso em número de volumes de coluna, que é observado na separação em pequena escala. Uma vez que a cromatografia preparativa é concluída, as frações coletadas são avaliadas analiticamente. O peptídeo puro é subsequentemente processado conforme definido pelas diretrizes do usuário.
Figura 2. Equações de escalonamento.
Os sistemas de cromatografia líquida mais simples configurados com uma bomba, um injetor, um detector UV e um coletor de frações são perfeitamente adequados para o isolamento de peptídeos (Figura 3). A detecção de massas, embora não seja necessária para o isolamento de peptídeos, identifica o peptídeo de destino e reduz o número de frações coletadas que requerem análise após o isolamento. Os compostos que não ionizam, ou ionizam mal, geralmente são detectados com UV de baixo comprimento de onda. Por outro lado, os peptídeos com atenuação de UV muito baixa, de modo geral, serão detectados prontamente com MS.
Figura 3. Diagrama do sistema de cromatografia líquida básico.
Considerações sobre o processo de purificação
Modos de separação
Como as propriedades dos diferentes peptídeos são muito diversas, os modos cromatográficos de separação também variam. Embora a cromatografia de fase reversa seja, de longe, o modo mais popular para a purificação de peptídeos, alguns peptídeos são isolados com mais eficiência por meio de uma seletividade alternativa, como a troca iônica ou a exclusão por tamanho. Essas técnicas alternativas também podem ser combinadas com a fase reversa, criando um processo de duas etapas para amostras difíceis.
Fase reversa
Devido à sua reprodutibilidade e ampla aplicabilidade, a cromatografia de fase reversa é frequentemente utilizada para a separação de muitos tipos de compostos, incluindo peptídeos. A sílica ligada por C18, um dos tipos mais populares de preenchimento de coluna de fase reversa, é apolar. Fases móveis de fase reversa, geralmente compostas de água com um solvente orgânico polar miscível, como acetonitrila ou metanol, eluem compostos de colunas C18 com base em sua polaridade. Portanto, quanto mais hidrofóbica for a natureza de um peptídeo, mais ele será retido em uma coluna C18.
Embora o C18 seja o preenchimento de fase reversa mais popular, outros ligantes (C4, C8, RP18, Fenil e outros) também podem ser ligados à partícula de base para fornecer seletividade alternativa para a separação otimizada de compostos. Embora a sílica tenha sido um dos primeiros substratos a ser utilizado para preenchimentos de fase reversa, os materiais de retenção à base de sílica impõem limites em relação à velocidade de separação, à resolução, ao pH, à temperatura e à capacidade de carregamento da coluna. A tecnologia de partículas híbridas exclusiva*, utilizada no desenvolvimento de novos substratos de coluna, cria partículas que podem ser operadas em velocidades, temperaturas e pH mais altos, enquanto melhora a seletividade, a resolução, a reprodutibilidade e a vida útil da coluna.
Troca iônica
A cromatografia de troca iônica tem sido empregada por muito tempo para o isolamento de proteínas e outros produtos biológicos. Como os aminoácidos em um peptídeo podem ser carregados positiva ou negativamente, a cromatografia de troca iônica pode ser aplicada ao isolamento de peptídeos. Resinas poliméricas naturais funcionalizadas como agarose, polímeros sintéticos, como poli(metilmetacrilato, MMA) ou poliestireno-divinilbenzeno são meios frequentemente utilizados para separações de moléculas grandes, uma vez que esses materiais podem suportar os rigorosos requisitos de limpeza que devem ocorrer entre os ciclos de processo e os lotes em bioprocessamento em grande escala. As soluções de hidróxido de sódio utilizadas nesses processos são prejudiciais para materiais à base de sílica frequentemente utilizados para isolamentos de moléculas pequenas e de peptídeos em pequena escala.
Existem quatro tipos de trocadores de íons: ânion fraco, cátion fraco, ânion forte e cátion forte. A troca catiônica é utilizada para reter e separar íons carregados positivamente em uma superfície negativa, enquanto a troca aniônica é empregada para reter e separar íons carregados negativamente em uma superfície positiva. As colunas de troca catiônica e de troca aniônica fortes são completamente ionizadas em um amplo intervalo de pH (2 a 12), enquanto as colunas de troca iônica fraca são carregadas em um intervalo estreito de pH (9,5 a 5,5).
O isolamento de peptídeos utilizando a troca catiônica é mais comum do que a troca aniônica, mas o modo preferido realmente depende da sequência do peptídeo. Para separações de peptídeos realizadas em um pH inferior a 3, as cargas negativas nos grupos carboxila das cadeias laterais de aminoácidos são neutralizadas e os grupos N-terminais são protonados, fazendo com que os peptídeos sejam carregados positivamente e atraídos para os locais negativos na coluna de troca catiônica (Figura 4).
Figura 4. Atração de peptídeos para o preenchimento de coluna de troca catiônica.
Por outro lado, para aqueles peptídeos mais adequados para separação entre pH 6 e 10, a troca aniônica pode ser utilizada. Com a troca aniônica em pH mais alto, os grupos carboxílicos no peptídeo são carregados negativamente e atraídos para os locais positivos na coluna de troca aniônica (Figura 5).
Figura 5. Atração de peptídeos para o preenchimento de coluna de troca aniônica.
Algumas sugestões gerais podem ser oferecidas para selecionar uma coluna e desenvolver um método para isolamento de peptídeos utilizando troca iônica. Tanto a troca aniônica quanto a catiônica podem ser empregadas. Como ponto de partida geral, os peptídeos ácidos são separados na troca aniônica, e os peptídeos básicos, na troca catiônica. Essa seleção pode ser revertida de forma útil para alguns peptídeos, especialmente os maiores, mas o pH deve ser ajustado de forma que a carga líquida seja o oposto do material de retenção.
Para qualquer uma das polaridades, trocadores fortes são preferidos para cromatografia de peptídeos. A carga em um peptídeo é uma função da sequência e do microambiente ao redor das cadeias laterais carregadas. Pequenos ajustes no pH da fase móvel podem ser utilizados para ajustar a seletividade de separação com base na sequência específica de peptídeos. Esses pequenos ajustes de seletividade não afetam a capacidade de ligação do trocador de íons forte.
A seleção da fase móvel e das condições operacionais é influenciada pelo fato de a separação por troca iônica ser planejada para ser a primeira etapa de uma purificação em duas etapas ou se for a única etapa de isolamento que produz o material experimental. Se o material coletado da troca iônica precisar ser purificado posteriormente com fase reversa, os tampões e as condições de eluição podem seguir as práticas usuais para troca iônica de proteína; por exemplo, utilizando tampões de fosfato ou Tris e eluindo com um gradiente de cloreto de sódio. Os sais serão removidos do produto na etapa subsequente.
Se a troca iônica for escolhida para produzir peptídeos utilizáveis em uma única etapa, é prudente escolher tampões voláteis que possam ser removidos por liofilização. O formiato de amônio é uma boa primeira opção, uma vez que tem duas regiões de tamponamento correspondentes aos pKs do amônio e do formiato. Pode ser utilizado de pH 3 a pH 4 para cromatografia de troca catiônica de peptídeos básicos ou de pH 9,25 a 10,25 para cromatografia de troca aniônica de peptídeos ácidos. A eluição pode ser realizada com um gradiente de força iônica de concentração crescente de formiato de amônio a um pH constante. Alternativamente, a eluição com um gradiente de pH reduz a liofilização demorada de tampões de alta força iônica. Novamente, os tampões de formiato de amônio fornecem um ponto de partida útil. A eluição prossegue de pH alto para baixo para peptídeos ácidos em trocadores de ânions e de pH baixo para alto para peptídeos básicos em trocadores de cátions.
Exclusão por tamanho
A separação cromatográfica de moléculas com base no tamanho, chamada atualmente de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC, Size-Exclusion Chromatography), data da década de 1950. A separação de moléculas com base no tamanho, em vez de em suas propriedades químicas, como carga ou polaridade, também é conhecida historicamente como cromatografia de permeação em gel (GPC, Gel Permeation Chromatography) ou cromatografia de filtração em gel (GFC, Gel Filtration Chromatography). Partículas de fase estacionária com uma distribuição de tamanho de poro definida excluem moléculas de amostra que são maiores do que as cavidades no leito da coluna, fazendo com que elas eluam muito rapidamente, enquanto moléculas pequenas entram nos poros e, subsequentemente, navegam em um caminho mais tortuoso e lento para a eluição. Portanto, as moléculas grandes eluem primeiro, enquanto as moléculas menores eluem em ordem decrescente de seu tamanho em solução (Figura 6). A SEC é uma técnica de baixa resolução que utiliza métodos isocráticos e não requer equilíbrio entre as corridas. O carregamento da coluna depende do volume e da concentração da amostra, que afetam a resolução.
Figura 6. Eluição da amostra por cromatografia de exclusão por tamanho.
Às vezes, a SEC é utilizada como uma etapa de cleanup inicial para remover sequências truncadas, peptídeos com desproteções incompletas e outras impurezas. À medida que um peptídeo sintético cresce em comprimento, o número desses contaminantes pode ser significativo. Qualquer etapa de purificação inicial simples antes do isolamento por fase reversa reduz a complexidade cromatográfica. A SEC também pode ser utilizada para a troca de tampão, ou seja, a alteração do tampão a partir do qual o peptídeo está dissolvido no momento para outro tampão ou solução que seja mais adequada para o próximo experimento ou etapa de purificação.
Resumo
Os peptídeos podem ser analisados e isolados utilizando muitas técnicas cromatográficas diferentes, incluindo fase reversa, troca iônica e exclusão por tamanho. A metodologia empregada na escala de semipreparação (alguns miligramas a algumas centenas de miligramas para isolamento) é normalmente de fase reversa. O restante desta discussão sobre o isolamento de peptídeos será dedicado aos fatores e às técnicas que podem ser empregados para otimizar a análise e purificação de peptídeos utilizando cromatografia de fase reversa.
Neste primer
Abordagens práticas para o isolamento de peptídeos
Considerações sobre o desenvolvimento de métodos
