Guia para iniciantes em SFC preparativa

Considerações sobre métodos analíticos

Quando um método analítico for escalonado para fins de purificação, é importante que a cromatografia seja a melhor possível para a aplicação. Melhor resolução na escala analítica significa melhor cromatografia na escala preparativa, resultando em maior rendimento e frações mais puras. Os métodos analíticos também devem levar em consideração as condições da técnica preparativa, como aquecimento da coluna, modo de injeção, quedas de pressão, pressão do sistema e colunas correspondentes. Se a purificação for por MS (Mass Spectrometry, espectrometria de massas), todo o screening e desenvolvimento de métodos na escala analítica também deverão ser feitos utilizando a detecção por MS. Para métodos de gradiente, a inclinação do gradiente e o tempo de equilíbrio precisam levar em conta a diferença de volumes entre os sistemas analítico e preparativo. O efeito do diluente também precisa ser levado em consideração, já que, muitas vezes, o carregamento analítico é feito utilizando injeções de fluxo misto, enquanto o método preparativo utiliza injeções no fluxo de modificador.

Carregamento

Tendo em mente a diferença nas estratégias de injeção, os estudos de carregamento são normalmente feitos primeiro na escala menor (analítica). É importante que se tenha conhecimento sobre a solubilidade dos compostos em uma amostra antes de introduzi-la no sistema. A melhor prática em aplicações preparativas é poder carregar o máximo de amostra na menor quantidade de solvente (amostras altamente concentradas). No entanto, a amostra também deve permanecer em solução após ser introduzida na fase móvel orgânica e de CO₂ combinada. Quando uma concentração aceitável for determinada, um estudo de carregamento de amostra é realizado, em que o volume de injeção é aumentado gradativamente até que a resolução seja perdida, ou a cromatografia não seja mais utilizável para obter frações puras dos compostos-alvo.

Requisitos gerais para um escalonamento bem-sucedido

Quando um método aceitável for desenvolvido e um estudo de carregamento for concluído na escala analítica, é ideal que a retenção e a seletividade sejam as mesmas (ou similares) no aumento de escala. Para escalonar a cromatografia com êxito, vários parâmetros precisam permanecer constantes:

■ As fases móveis precisam ser idênticas; na SFC, isso significa um cossolvente idêntico (solvente B) e que o CO₂ deve ser de qualidade, pressão de entrada, estado físico (líquido ou gás) e método de fornecimento semelhantes.

■ As colunas precisam ter o mesmo recheio, comprimento e tamanho de partícula para ter a melhor chance de correspondência cromatográfica em diferentes escalas. Se colunas de pequeno tamanho de partícula estiverem sendo utilizadas na escala analítica, a razão entre o comprimento e o tamanho da partícula (L/dp) deve ser a mesma entre as colunas.

■ As amostras precisam ter a mesma concentração e dissolver o mesmo diluente.

Escalonamento geométrico

Na SFC preparativa, assim como na LC, os volumes de injeção (carregamento) e as taxas de fluxo são dimensionados geometricamente.

Para manter o formato do pico e a capacidade de carregamento, o volume de injeção precisa ser dimensionado adequadamente de acordo com o tamanho da coluna. A capacidade é determinada pela seguinte equação:

onde Vol é o volume de injeção (µL), D é o diâmetro interno da coluna (mm), e L é o comprimento da coluna (mm).

Da mesma forma, para manter a qualidade da separação, a taxa de fluxo é dimensionada com base nas dimensões da coluna. Com colunas de comprimento e tamanho de partícula idênticos, o escalonamento geométrico da taxa de fluxo é o seguinte:

onde F é a taxa de fluxo (mL/min), e D é o diâmetro interno da coluna (mm).

Volume morto e volume extracoluna:

Quando as colunas têm comprimento idêntico, as alterações no perfil do gradiente no método preparativo são necessárias com base no volume morto. Para fazer esses ajustes, o volume morto deve ser medido para o sistema analítico e preparativo. Para determinar o volume morto, normalmente um composto ou solvente que fornece sinal UV é adicionado ao cossolvente, e um gradiente é executado sem uma coluna. Com base no atraso de tempo entre o início do gradiente nas bombas e a mudança no sinal no detector, o volume morto pode ser determinado pela multiplicação do atraso de tempo pela taxa de fluxo (Figura 25).

Também é importante observar o impacto de qualquer volume extracoluna, como tubulação, válvulas de injeção, tamanho do loop, células de fluxo do detector e divisores, que pode resultar em alargamento de faixa na cromatografia final. Para medir o volume extracoluna e o alargamento de faixa, a coluna é removida, e é feita uma injeção. O tempo entre a injeção e a detecção, multiplicado pela taxa de fluxo, é igual ao volume extracoluna. O formato de pico sem uma coluna indica qualquer alargamento ocorrendo como resultado do volume extracoluna. Como o sistema foi conectado para injeção no fluxo de modificador, a injeção foi feita com 100% de cossolvente, para que o volume pudesse ser determinado com mais exatidão e sem a adição de CO₂ após a injeção. Os detalhes sobre esse procedimento estão incluídos na Calculadora de colunas preparativas OBD, um aplicativo on-line que pode ser acessado no site www.waters.com.A calculadora de colunas fornece uma ferramenta fácil de utilizar que ajuda em todos os cálculos de escalonamento analítico para preparativo.

Considerações sobre densidade de fase móvel

As regras simples de aumento de escala para LC, embora aplicáveis na SFC, não podem ser aplicadas diretamente, pois pressupõem densidade constante da fase móvel. O aumento de escala na SFC é mais complexo, principalmente devido à compressibilidade da fase móvel, causando variações de densidade, pressão e temperatura na coluna e entre sistemas. As variações nesses fatores têm um impacto na composição e na força da fase móvel. Os efeitos resultantes na retenção e seletividade tornam mais difícil manter o perfil de separação entre os sistemas de escala analítica e preparativa.

As variações de densidade e temperatura não podem ser controladas diretamente, mas a cromatografia pode ser correspondida com êxito em várias escalas por meio do ajuste dos seguintes parâmetros de método na SFC:

■ Corresponder a pressão média (e, portanto, a densidade média) entre os sistemas. A pressão média é igual à soma da contrapressão e da pressão frontal dividida por dois. As pressões podem ser correspondidas alterando a configuração do regulador automatizado de pressão nos equipamentos analíticos ou preparativos para manter perfis de pressão (densidade) semelhantes em toda a coluna. Deve-se observar que corresponder a pressão média nem sempre garantirá um perfil de densidade correspondente; no entanto, os perfis mostrarão uma melhor concordância.

■ Combinação precisa da composição da fase móvel de dióxido de carbono e cossolvente. Isso é basicamente uma conversão de unidade entre sistemas de fluxo de volume para fluxo de massa (na escala analítica) ou fluxo de massa para fluxo de volume (na escala preparativa) para ter fases móveis equivalentes.

Na SFC, a composição do cossolvente é o parâmetro mais importante que controla a retenção do pico. Como resultado, o escalonamento exato da composição do cossolvente é essencial para o aumento de escala do método. Ao combinar o fluxo de massa e a composição do CO₂ e do cossolvente junto com a pressão e a temperatura de saída da coluna, é possível aumentar a escala de maneira segura de um equipamento baseado em fluxo de volume para um equipamento baseado em fluxo de massa.

Exemplo de aumento de escala

Neste exemplo, o método analítico foi desenvolvido no sistema UPC² com os seguintes parâmetros (tabela 6).

A fim de manter o tamanho de partícula e o comprimento da coluna constantes, uma coluna Chiralpak IA de 21 x 150 mm com partículas de 5 µm foi utilizada no sistema preparativo. O volume de injeção foi dimensionado geometricamente, de modo que a injeção de 10 µL na coluna de diâmetro interno de 4,6 mm equivalesse a uma injeção de 208 µL na coluna de diâmetro interno de 21 mm. Nesse caso, a bomba de CO₂ no sistema analítico era controlada por fluxo de volume, enquanto a bomba no sistema preparativo era controlada por fluxo de massa. Como resultado, a taxa de fluxo de CO₂ do método analítico precisou ser convertida em fluxo de massa antes de calcular o aumento de escala geométrica. Isso foi feito com a seguinte equação.

■ Fluxo de CO₂ = 2,67 mL/min

■ Densidade de CO₂ = 0,89 g/mL

■ Fluxo de CO₂ (massa) = fluxo de CO₂ x densidade de CO₂

■ Fluxo de CO₂ (massa) = 0,89 x 2,67 = 2,38 g/min

Como o cossolvente é dimensionado normalmente (mL a mL) e a taxa de fluxo do cossolvente foi de 0,33 mL/min, a taxa de fluxo analítica total foi de 2,70 g/min a aproximadamente 12% de metanol. Essa taxa de fluxo e porcentagem foram escalonadas geometricamente, resultando em uma taxa de fluxo preparativa de 56 g/min na coluna de 21 x 150 mm em condições de cossolvente de 12%.

Quando o fluxo e a composição foram determinados, o perfil de densidade precisou ser combinado com o sistema analítico utilizando a mesma pressão média. A pressão frontal no sistema analítico foi de 162 bar e a contrapressão de 120 bar (a queda de pressão foi de 42 bar), então a pressão média foi calculada em 141 bar. Como a queda de pressão no sistema preparativo foi de apenas 24 bar, a contrapressão precisou ser ajustada para 130 bar para coincidir com a pressão média do sistema analítico. Por fim, a temperatura também foi combinada em 35 °C. Utilizando esses parâmetros, o aumento de escala bem-sucedido da separação do Sistema ACQUITY UPC² para o sistema SFC preparativa é mostrado na Figura 26. Os perfis são os mesmos, no entanto, há um pequeno aumento na retenção no sistema preparativo, provavelmente devido à diferença na estratégia de injeção. O sistema analítico utilizou injeção de fluxo misto, enquanto o sistema preparativo utilizou injeção no fluxo de modificador.

Empilhamento de injeções

Para muitas aplicações, são utilizadas injeções empilhadas. As injeções empilhadas reduzem o tempo entre os ciclos de injeção e minimizam a utilização de solvente. As injeções empilhadas também melhoram significativamente o rendimento utilizando todo o espaço cromatográfico disponível para separação e purificação contínuas. Normalmente, as injeções são feitas enquanto uma amostra já injetada está na (ou eluindo da) coluna. Portanto, para utilizar injeções empilhadas, são necessários métodos isocráticos. Para empilhar as injeções com êxito, o tempo de ciclo correto (ou tempo entre as injeções) precisa ser determinado. Além disso, o tempo total de corrida é necessário para a última injeção na sequência para garantir que todos os conjuntos de picos sejam eluídos e coletados. A Figura 27 mostra como esses valores são determinados e, em seguida, aplicados em um conjunto de injeções empilhadas. Como o tempo de ciclo é de cerca de metade do tempo total de corrida, duas injeções são feitas antes mesmo de o primeiro pico de destino começar a eluir. Após a última injeção ser feita, dois conjuntos de picos eluem e são coletados. Nesse caso, a utilização de injeções empilhadas reduz o tempo total de processamento pela metade em comparação com corridas de injeção única convencionais.

Exemplos de aplicações

Devido ao intervalo de seletividade expandido da SFC descrito anteriormente, a técnica é adequada para uma ampla variedade de aplicações (Tabela 7).

Tabela 7. Aplicações de SFC preparativa por área de mercado.

Independentemente da área de mercado ou do objetivo da purificação, a SFC preparativa fornece:

■ Seletividade diversa em uma plataforma única e fácil de utilizar

■ Intervalo de escalonamento cromatográfico

■ Aumento da produtividade e economia de solventes

■ Ortogonalidade para LC de fase reversa

■ Separação e purificação de compostos com similaridade estrutural

Nesta seção, são apresentados trechos de exemplos de aplicações para mostrar diferentes rotinas de trabalho e áreas de aplicação. Todas essas aplicações podem ser vistas na íntegra no site da Waters em www.waters.com.

Purificação quiral de sabores e fragrâncias voláteis por SFC

Uma das principais áreas de aplicação da SFC são as separações quirais. Assim como os enantiômeros dos medicamentos quirais exibem atividade farmacológica diferente, a estereoquímica dos compostos de sabor e fragrância estabelece o sabor, a qualidade do odor e a intensidade. A purificação desses compostos pode ser bastante desafiadora devido à sua volatilidade. A SFC oferece uma opção rápida e de baixa temperatura para alta recuperação de compostos de fragrâncias e sabores quirais.

Aqui, os enantiômeros de linalol e terpinen-4-ol foram purificados a partir de óleos essenciais de lavanda e de melaleuca, respectivamente, utilizando SFC preparativa quiral com injeções empilhadas. A Figura 28 mostra o aumento de escala dos métodos analíticos na coluna AD-H de 4,6 x 250 mm para a coluna AD-H semipreparativa de 10 x 250 mm. A separação do óleo de melaleuca mostra que ambos os enantiômeros de terpinen-4-ol estão presentes, enquanto o óleo de lavanda contém apenas um dos enantiômeros de linalol. Os parâmetros de métodos de SFC preparativa são exibidos na Tabela 8.

Os métodos eram isocráticos, então injeções empilhadas foram utilizadas, maximizando a eficiência da coleta. Com base na cromatografia, o tempo de ciclo foi de aproximadamente 3 minutos para o óleo de melaleuca e de 2 minutos para o óleo de lavanda. A purificação quiral resultante utilizando injeções empilhadas é exibida na Figura 29, em que 50 mg de óleo de melaleuca foram processados em menos de 40 minutos e 30 mg de óleo de lavanda foram processados em menos de 30 minutos.

A análise de fração é exibida na Figura 30, em que a pureza para todas as três frações foi maior que 92%. Os estudos de recuperação foram realizados utilizando padrões racêmicos de terpinen-4-ol e linalol, resultando em uma recuperação de 70 a 80%, o que foi notável devido às recuperações relativamente baixas normalmente relatadas.

Purificação aquiral de um composto farmacêutico utilizando acionamento de fração baseado em MS

Com a purificação direcionada por UV, os picos não podem ser distinguidos uns dos outros pelos detectores. Muitos compostos são absorvidos no mesmo comprimento de onda. A purificação direcionada por massa coleta frações com base na massa, que é um parâmetro muito mais específico porque distingue entre o(s) alvo(s) e quaisquer impurezas. Quando os insumos farmacêuticos ativos são sintetizados, às vezes há impurezas intermediárias presentes no produto final.

O imatinibe é um inibidor da tirosina-quinase utilizado no tratamento de vários tipos de câncer. Aqui, o intermediário de reação e os produtos finais foram purificados para a síntese de imatinibe. Na primeira etapa, a mistura foi submetida a screening utilizando três colunas aquirais e metanol com e sem um aditivo de hidróxido de amônio. Os resultados do screening são mostrados na Figura 31. A coluna BEH 2-EP e o metanol com hidróxido de amônio foram escolhidos como os melhores parâmetros de método para otimização e aumento de escala.

Para otimizar a separação para aumento de escala, foram desenvolvidos gradientes focados para o intermediário e o produto separadamente. A concentração de cossolvente na eluição foi calculada com base na inclinação do gradiente de screening e no tempo de retenção para cada pico de interesse. O intermediário eluiu a 14% de cossolvente, enquanto o produto eluiu a 29% de cossolvente. Gradientes focados de 2 minutos foram desenvolvidos com base nessas porcentagens; começando 5% mais baixos e terminando 5% mais altos.

Para aumento de escala, o mesmo recheio de coluna foi utilizado, e a relação entre o comprimento e o tamanho da partícula (L/dp) foi mantida constante. A coluna analítica de 3 x 50 mm com partículas de 1,7 µm (L/dp = 29,4) escalonada para a coluna preparativa de 19 x 150 mm com partículas de 5 µm (L/dp = 30). A cromatografia em escala (focada) e a coleta direcionada por massa são exibidas na Figura 32.