A tecnologia de fluido supercrítico (SFx) é o conceito subjacente à purificação baseada em SFC. As técnicas de SFx da Waters incluem extração (SFE), cromatografia analítica (UPC²) e cromatografia preparativa (SFC preparativa); todas as quais utilizam CO₂ subcrítico ou supercrítico como solvente principal. Ao substituir os solventes líquidos orgânicos e aquosos por CO₂, a tecnologia SFx fornece uma alternativa ortogonal, ecologicamente correta e mais econômica à purificação à base de líquidos. A SFx é considerada uma tecnologia "verde" porque tem uma pegada ecológica reduzida devido à falta de resíduos de solvente orgânico. Em comparação com a purificação LC, essa tecnologia fornece melhorias na velocidade e seletividade, o que significa que o tempo e o custo necessários para ir de um material de partida complexo a um produto final são bastante reduzidos. Com os avanços recentes na tecnologia de equipamentos, uma ampla variedade de aplicações de purificação agora está aproveitando todo o poder de separação das técnicas de SFx.

Muitas substâncias requerem condições extremas para atingir seu estado supercrítico e exibem propriedades indesejáveis quando estão nesse estado. Na Tabela 1, são mostradas as condições do fluido supercrítico e as propriedades associadas de algumas substâncias supercríticas selecionadas. Ao contrário de outras substâncias supercríticas, o CO₂ é geralmente considerado seguro porque não é inflamável, explosivo, tóxico ou corrosivo. Como o estado supercrítico do CO₂ é facilmente atingido, a 31 °C e 74 bar, a densidade pode ser manipulada a temperaturas e pressões dentro de um intervalo aceitável. Além disso, devido à temperatura crítica relativamente amena, é favorável a amostras termicamente instáveis. O CO₂ também é relativamente barato porque é facilmente recuperado de outros processos industriais; isso significa que tem um impacto neutro nos níveis ambientais de CO₂. Todas essas vantagens tornam o CO₂ a substância mais comum utilizada em tecnologias de fluidos supercríticos.

Uma rotina de trabalho de purificação consiste em várias etapas, variando em complexidade e necessidade com base nos requisitos da aplicação. Em um nível básico, uma rotina de trabalho de purificação SFx contém os seguintes componentes.

Amostra ou material inicial: A amostra pode ser complexa, como em um produto botânico que ocorre naturalmente, ou relativamente simples, como um candidato a produto farmacêutico bem caracterizado. Isso determinará a quantidade necessária, se houver, de preparo de amostra e a escala de purificação. Também é recomendável ter o máximo de informações possível sobre a amostra e o eventual produto, como estabilidade térmica, polaridade, solubilidade e reatividade que estabelecem a maneira como essa amostra pode ser tratada.

Preparo da amostra: Na primeira etapa do processo de purificação, a amostra precisa ser preparada adequadamente, dependendo do estado do material inicial e do objetivo ou escopo da aplicação. O preparo de amostra pode ter várias etapas, como trituração, secagem, extração e filtragem, ou simplesmente dissolução da amostra em solução. A extração com fluido supercrítico (SFE, Supercritical Fluid Extraction) é a primeira etapa (preparo da amostra) em uma rotina de trabalho de SFx. É normalmente utilizada em aplicações que envolvem produtos industriais brutos, biobotânicos ou produtos naturais.

Purificação da amostra: A purificação é utilizada para diminuir a complexidade da amostra ou isolar um produto final dentro de uma determinada especificação de pureza para análise ou formulação do produto. As amostras preparadas por SFE são normalmente misturas complexas contendo compostos-alvo e impurezas. Em uma rotina de trabalho de SFx, a cromatografia de fluido supercrítico preparativa (SFC preparativa) é a segunda etapa (purificação), em que um ou vários destinos são purificados a partir de um extrato. A SFC preparativa também pode ser aplicada a amostras preparadas utilizando muitos métodos diferentes, não apenas pela SFE.

Produto final: O produto final é a meta final da rotina de trabalho. Podem ser dados e informações gerados por análise, um material refinado utilizado em um processo ou um produto final que pode ser utilizado diretamente. O produto final determina os equipamentos e a metodologia necessários para uma rotina de trabalho bem-sucedida. Em uma rotina de trabalho de SFx, a análise de amostras pré e pós-extração (SFE) e a purificação (SFC preparativa) são realizadas utilizando a UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC²).

Qualquer uma dessas tecnologias SFx pode ser utilizada, conforme necessário, em rotinas de trabalho não SFx, como etapas de preparo, purificação ou análise.

A cromatografia líquida de alto desempenho preparativa (HPLC preparativa) tem sido uma das técnicas mais utilizadas para purificação por mais de 20 anos. Especificamente, ela consiste em um processo de separação popular nas indústrias de substâncias químicas finas, farmacêutica e de biotecnologia, onde é amplamente utilizada para a purificação de produtos. Com o passar do tempo, a HPLC preparativa tornou-se uma técnica muito eficiente e aplicável, especialmente para a purificação aquiral. A cromatografia líquida de fase reversa (RPLC, Reversed-Phase Liquid Chromatography) tem a vantagem de utilizar uma fase estacionária quase universal (C₁₈) e uma mistura de fases móveis de água e acetonitrila que é geralmente aplicável. A RPLC é compatível com a Espectrometria de Massas (MS, Mass Spectrometry), e a RPLC associada à MS (RPLC-MS) tem sido a abordagem padrão para purificação em muitos ambientes de pesquisa.

Apesar de sua popularidade, a HPLC preparativa tem várias desvantagens. O volume de fase móvel necessário para purificar uma determinada massa de composto é grande em comparação com a quantidade total da amostra que é processada. As frações típicas de HPLC preparativa contêm grandes volumes de solvente (orgânico e aquoso), o que cria um gargalo para a produtividade devido ao tempo e à energia necessários para secar e obter o produto final.

Os solventes utilizados na LC podem poluir o meio ambiente, tanto localmente (por meio de evaporação e exposição) quanto em uma escala maior por meio da queima de resíduos químicos. A cromatografia líquida de fase normal (NPLC, Normal-Phase Liquid Chromatography) é considerada ainda mais prejudicial ao meio ambiente, pois a fase móvel é normalmente composta por solvente 100% orgânico. Devido a esses fatores ambientais, a aquisição e o descarte de solventes usados na LC estão ficando cada vez mais caros, o que gera um incentivo para processos mais livres de solventes ou mais verdes. A SFC é uma técnica alternativa, que pode ajudar a aliviar o gargalo e produzir refinamentos operacionais que encurtam os prazos, reduzem os resíduos de solvente e cortam custos. Recentemente, o avanço dos equipamentos de SFC levou a um interesse renovado na técnica como uma ferramenta poderosa para a purificação quiral e aquiral. A SFC é uma alternativa ambientalmente mais "verde" à HPLC para análise e purificação.

A cromatografia de fluido supercrítico (SFC, Supercritical Fluid Chromatography) é uma técnica cromatográfica que utiliza CO₂ subcrítico (líquido) e supercrítico como solvente principal na fase móvel, geralmente acompanhada por um solvente orgânico. Como toda cromatografia, a SFC separa os componentes com base na partição de analitos entre uma fase estacionária (coluna) e uma fase móvel (solvente). Existem muitas semelhanças entre a HPLC e a SFC, por exemplo: a SFC pode ser processada utilizando condições de método isocráticas e de gradiente e é compatível com todas as técnicas de detecção padrão, como ultravioleta (UV, Ultraviolet), arranjo de fotodiodos (PDA, Photodiode Array), espalhamento de luz evaporativa (ELS, Evaporative Light Scattering) e Espectrometria de Massas (MS, Mass Spectrometry). A rotina de trabalho geral de SFC preparativa é a mesma que para HPLC envolvendo desenvolvimento de métodos, aumento de escala, coleta de frações e análise de pureza das frações coletadas (Figura 3). Também é comparável à RPLC em termos de recuperação e pureza, para algumas aplicações, a recuperação é melhor na SFC, enquanto para outras, a HPLC é a melhor solução.

A SFC geralmente utiliza os princípios da cromatografia de fase normal. O que torna a SFC diferente da HPLC é a utilização de CO₂ como o principal componente da fase móvel; substituição de componentes líquidos não polares, como hexanos e heptanos. Como o CO₂ supercrítico é um fluido compressível, a pressão e a temperatura tornam-se parâmetros importantes utilizados para controlar a força do solvente, afetando a retenção e a seletividade. O CO₂ supercrítico é favorável para purificação cromatográfica por ser não inflamável, não tóxico e ter alta difusividade, baixa viscosidade e excelente poder de solvatação. Nos últimos anos, a SFC se tornou uma técnica atrativa para os laboratórios de purificação, proporcionando vantagens significativas em termos de economia de solvente e produtividade.

Uma grande vantagem da SFC preparativa é a menor utilização de solvente obtida por meio da substituição da maior parte da fase móvel por CO₂. Na escala analítica, essa vantagem pode ser pequena, mas, na escala preparativa, a vantagem é bastante significativa. Em muitos laboratórios de purificação, uma quantidade significativa de tempo pode ser gasta na remoção do solvente das frações coletadas, criando um gargalo entre a purificação de um composto e a obtenção do produto de destino ou do resultado desejado. Na SFC preparativa, a porção de CO₂ da fase móvel é removida na despressurização, deixando apenas uma pequena quantidade de cossolvente. As frações resultantes têm concentrações de produto mais altas, o que reduz o tempo necessário para a remoção do solvente e o isolamento do produto. A fração também pode ser analisada diretamente sem a necessidade de etapas de enriquecimento ou concentração de amostra. Isso tem uma importância específica para compostos que se decompõem rapidamente sob condições normais de secagem prolongada.

Outras vantagens da menor utilização de solvente orgânico na SFC são a economia de custos, a segurança em relação à inflamabilidade e a toxicidade, e a redução do impacto no meio ambiente. Há uma vantagem de custo/benefício considerável em termos de aquisição e descarte de solvente; no entanto, também há economia devido ao menor consumo de energia necessário para a remoção do solvente. A SFC também pode evitar a utilização de solventes tóxicos, como acetonitrila, usados na RPLC, e os hidrocarbonetos alifáticos e solventes clorados usados na NPLC. O CO₂, como solvente, é relativamente barato porque é um subproduto proveniente de outros processos industriais, além de ser reciclável.

Vantagens da SFC preparativa: Maior produtividade

Na SFC, a produtividade é aumentada devido à baixa viscosidade e alta difusividade da fase móvel, o que melhora a velocidade e eficiência cromatográfica. A Figura 4 mostra uma comparação das curvas de van Deemter para HPLC, UPLC, SFC e UPC². Na cromatografia, a velocidade das separações é determinada em parte pela rapidez com que o soluto se difunde na fase móvel e para dentro e fora da fase estacionária. As curvas de van Deemter para SFC são mais amplas e planas do que para HPLC, indicando que a eficiência da cromatografia permanece alta (valores baixos de altura da placa) conforme a taxa de fluxo (velocidade linear) aumenta. Na SFC, os coeficientes de difusão mais altos se traduzem diretamente em cromatografia de alta velocidade.

Devido à viscosidade mais baixa da fase móvel, as pressões da coluna e do sistema são mais baixas, permitindo velocidades lineares de até 3 a 4 vezes maiores do que as vistas na HPLC, e a utilização de colunas de tamanho de partícula menor. A baixa viscosidade também resulta em tempos de equilíbrio mais curtos. O resultado são tempos de corrida curtos com alta eficiência de separação, levando a uma maior capacidade de carregamento e um tempo de ciclo de injeção menor; parâmetros-chave para melhorar a produtividade em qualquer processo de cromatografia preparativa. Portanto, compostos puros podem ser gerados em um período de tempo mais curto, resultando em maior produtividade geral. Um exemplo da economia de tempo e produtividade entre HPLC e SFC pode ser visto na Tabela 2.

A relação ortogonal entre SFC e RPLC fornece uma oportunidade de melhorar a qualidade do produto em muitas aplicações. A RPLC aplica a coluna C₁₈ como uma solução quase universal, o que simplifica muito o desenvolvimento de métodos, mas a fase móvel aquosa limita o intervalo de compatibilidade do solvente e de solubilidade do composto. Por outro lado, a SFC funciona bem com uma ampla variedade de diluentes orgânicos, resultando em uma maior variedade de compatibilidade com solventes e compostos. Ela também possui uma ampla variedade de fases estacionárias para escolher.

A SFC é ortogonal à RPLC porque geralmente é considerada cromatografia de fase normal e fornece uma diversidade de opções de separação em um formato cromatográfico fácil de utilizar. Em particular, ao associar a seletividade de fase normal com alta eficiência de separação, a SFC tem uma vantagem ao separar estereoisômeros, isômeros posicionais e compostos estruturalmente semelhantes. Para compostos não polares, a flexibilidade da SFC permite a utilização de colunas de fase reversa (como C₁₈), enquanto a inclusão de água como aditivo estende o intervalo de aplicação para a região mais polar. Nas aplicações em que os compostos são facilmente degradados, a purificação SFC é uma alternativa ideal porque as separações são realizadas rapidamente, sem água, e a secagem da fração é concluída a baixas temperaturas e em menos tempo.

A SFC preparativa é comparável à RPLC em termos de recuperação e pureza, e há uma sobreposição nas aplicações que podem ser feitas por SFC e RPLC. A Figura 5 mostra os resultados de um estudo no qual uma biblioteca farmacêutica de compostos foi submetida a screening para purificação SFC e LC. Aproximadamente 82% dos compostos puderam ser purificados por qualquer uma das técnicas. No entanto, o estudo também mostra como as duas plataformas são complementares. Alguns compostos só puderam ser purificados por SFC (4%), enquanto outros só puderam ser purificados por LC (8%). A flexibilidade proporcionada pela associação das duas plataformas oferece uma oportunidade maior para otimizar a separação e a purificação. A SFC fornece uma seletividade que é complementar à RPLC, permitindo uma abordagem ortogonal no desenvolvimento de métodos e na separação de amostras complexas desafiadoras. Ao realizar a purificação em várias etapas entre as plataformas, ou ao utilizar uma técnica ortogonal para análise de fração, um produto mais puro pode ser recuperado e mais informações obtidas. Um exemplo de purificação de um composto a partir de uma matriz complexa utilizando separações por LC e SFC ortogonais é exibido na Figura 6.