Guia para iniciantes em SFC preparativa

Caminho de fluxo e hardware

Como resultado dos avanços nos equipamentos modernos de SFC (Supercritical Fluid Chromatography, cromatografia de fluido supercrítico) preparativa, muitos dos obstáculos associados à SFC preparativa foram superados. A Figura 7 mostra o caminho de fluxo geral para os equipamentos de SFC preparativa. A SFC utiliza o mesmo caminho de fluxo básico que a HPLC (High Performance Liquid Chromatography, cromatografia líquida de alto desempenho), incluindo bombeamento binário e controle de método, introdução de amostra no caminho de fluxo utilizando injeções, separações baseadas em coluna, detecção de pico e coleta de fração. Na SFC, outras tecnologias são necessárias, principalmente para lidar com a compressibilidade e expansão de CO₂. Isso inclui trocadores de calor (HEs, Heat Exchangers), reguladores de contrapressão (BPRs, Back Pressure Regulators), separadores de gás-líquido (GLSs, Gas Liquid Separators) e a utilização quase universal de tubulação de aço inoxidável de alta pressão.

Considerações para cada componente

Bombeamento: Na SFC, como na LC, os sistemas de bombeamento binários são utilizados para fornecer um solvente "A", nesse caso, sempre CO₂, e um solvente "B", normalmente um solvente orgânico polar como o metanol. Dependendo da escala do sistema, o CO₂ é fornecido de duas maneiras, volumetricamente (fluxo de volume), o que é típico na escala analítica, ou por massa (fluxo de massa), como geralmente é feito na escala preparativa. Como o CO₂ é compressível, volumes idênticos não são necessariamente iguais a massas idênticas devido às diferenças de densidade. Qualquer um dos métodos de entrega é válido, desde que as taxas de fluxo sejam reprodutíveis, independentemente das condições ambientais. Na maioria dos casos, o CO₂ é resfriado antes da bomba ou dentro dos cabeçotes da bomba e, em seguida, bombeado como um líquido para reduzir qualquer discrepância na densidade da fase móvel. Além disso, todas as vedações, válvulas de retenção, tubulação e conexões precisam ser capazes de suportar um fluido compressível de alta pressão sem ocorrer vazamentos. Como o CO₂ se expande facilmente através de qualquer abertura, mesmo um pequeno vazamento pode ter um grande impacto no desempenho do sistema e na cromatografia. O bombeamento inadequado de CO₂, seja devido a vazamentos na tubulação, vedações ou válvulas de retenção, pode resultar não apenas em alterações no tempo de retenção e na seletividade, mas também no controle de pressão (densidade) e no ruído da linha de base insatisfatórios.

Injeções: Existem dois modos de injeção frequentemente utilizados, fluxo misto e fluxo de modificador, que serão discutidos em detalhes na seção "Estratégias de injeção na SFC". Os esquemas de injeção por SFC de fluxo misto envolvem uma etapa de despressurização, utilizada para ventilar qualquer CO₂ do loop antes de carregar a amostra. A despressurização também é utilizada ocasionalmente em sistemas que fazem injeções no fluxo misto e no fluxo de modificador como uma precaução de segurança. Normalmente, isso é feito com uma válvula de "respiro" secundária. Uma desvantagem dessa configuração é o volume extracoluna acrescentado ao sistema durante a injeção, o que pode levar ao alargamento dos picos e a uma perda na resolução. Ao manter o volume no mínimo utilizando uma tubulação de diâmetro interno pequeno, o alargamento dos picos é reduzido.

Forno de coluna e aquecimento: Na SFC, a pressão e a temperatura são parâmetros de método que afetam a separação porque afetam a densidade da fase móvel. Por isso, o aquecimento e o controle da temperatura adequados da fase móvel e da coluna são necessários. Se a temperatura não for controlada adequadamente, os gradientes de temperatura que ocorrem na coluna podem ter efeitos prejudiciais no formato e na resolução dos picos. Em muitos sistemas SFC, esse processo é feito por meio do aquecimento da coluna em um forno ou do pré-aquecimento da fase móvel, ou de ambos.

Identificar o recheio certo para a coluna (quiral e aquiral) é fundamental na SFC. Por isso, o screening de coluna é necessário em aplicações de SFC. Muitos sistemas SFC são equipados com algum tipo de válvula de alternância incluída no forno para escolher entre várias colunas. Isso é especificamente importante em aplicações em que muitas amostras e destinos diferentes estão sendo purificados, o que provavelmente exige diferentes recheios de coluna.

Detectores: Todas as técnicas de detecção típicas utilizadas na purificação, como UV/Vis, PDA, MS e ELS, são compatíveis com SFC, e vários detectores podem ser usados em um único sistema. Normalmente, os detectores UV/Vis e PDA são conectados ao caminho de fluxo principal porque são detectores não destrutivos e são utilizados para detecção primária. As células de fluxo para esses detectores precisam ser classificadas adequadamente de acordo com as pressões utilizadas em SFC. Os detectores destrutivos, como o MS e o ELS, são conectados utilizando a tecnologia de divisor que tem controle relativo da razão de separação e condiciona o solvente para otimizar o sinal de detecção. Vários sinais de detector (ou canais) podem ser registrados ou utilizados para o acionamento de fração, expandindo a faixa de aplicação da tecnologia para SFC analítica e preparativa. A utilização desses detectores na SFC é abordada com mais detalhes na seção "Detecção óptica e de MS na SFC" deste capítulo.

Regulador de contrapressão (BPR, Back Pressure Regulator): O controle da densidade da fase móvel ao longo da coluna é um dos fatores mais importantes no projeto do equipamento de SFC, pois a solubilidade e o fator de retenção de todos os compostos estão estreitamente relacionados à densidade do fluido. O controle de densidade é realizado principalmente pelo controle da pressão dentro do sistema. O regulador de contrapressão é um dispositivo automatizado projetado para controlar a pressão pós-coluna (contrapressão) do sistema a uma pressão especificada dentro do método. Para adquirir uma cromatografia adequada e reprodutível, a pressão pós-coluna deve permanecer constante (no ponto de ajuste), mesmo sob condições de gradiente e corrida a corrida. 

Embora o CO₂ seja considerado supercrítico acima de 74 bar (aprox. 1073 psi) e 31 °C, normalmente não é recomendado fazer corridas em condições próximas ao ponto crítico, pois pequenas alterações na temperatura ou pressão nessa região resultam em grandes alterações na densidade. Consequentemente, os métodos desenvolvidos nessa região seriam menos robustos em termos de retenção e resolução. Além disso, quando cossolventes estão sendo utilizados, a separação de fases é mais provável em condições de baixa pressão, resultando em ruído da linha de base. Portanto, a maioria dos métodos de SFC utiliza pontos de ajuste de pressão mais altos, normalmente maiores que 100 bar (1450 psi).

Acionadores de coleta: Na SFC preparativa, as coletas podem ser acionadas em vários canais e detectores por meio da utilização dos modos de coleta de limiar, tempo e inclinação (definidos na tabela 3). A lógica boolean é utilizada para uma coleta mais inteligente, exigindo que mais de uma condição seja atendida antes que a coleta ocorra. As condições de coleta podem incluir combinações de modos, como limiar e tempo, ou combinações de sinais de detector, como limiar de UV e confirmação de massas.

Tabela 3. Definições dos modos de coleta utilizados na SFC preparativa.

O atraso no tempo de coleta também é importante, e atrasos adequados entre o detector e o sistema de coleta devem ser determinados para a recuperação ideal dos compostos-alvo. Assim como na HPLC preparativa, esses atrasos dependem das taxas de fluxo. No entanto, na SFC, as alterações no tempo de coleta também acompanham as alterações na pressão e na composição da fase móvel. Com a utilização de solventes complementares e de outras tecnologias para mitigar a expansão de CO₂, o tempo pode ser melhor controlado em uma variedade de condições a uma taxa de fluxo definida.

Estratégias de injeção em SFC

Atualmente, existem duas abordagens para injeção de amostra em aplicações de SFC: fluxo misto e fluxo de modificador. Na injeção de fluxo misto, toda a fase móvel (CO₂ e cossolvente) varre o loop e carrega a amostra para a coluna. Problemas comuns com a injeção de fluxo misto são a distorção de pico e os deslocamentos do tempo de retenção causados por fortes efeitos de diluente. A prática padrão é dissolver a amostra no modificador polar (cossolvente). A utilização de um solvente forte, como o metanol, faz com que parte do analito não seja absorvida na fase estacionária, resultando em ruptura ou distorção dos picos. Para picos que são menos retidos, há um impacto maior, e a distorção se torna mais acentuada. À medida que o volume de injeção aumenta, o slug de solvente polar causa distúrbios localizados na fase móvel, distorcendo ainda mais os picos e, ao mesmo tempo, diminuindo a resolução. Essa estratégia de injeção também requer despressurização, o que pode ter um impacto no carregamento da injeção e na repetibilidade. Com a injeção de fluxo misto, diluentes com polaridade semelhante ao CO₂ (como hexano, heptano ou outros solventes não polares) mostraram melhorar o formato de pico (Figura 8).

A segunda estratégia de injeção é a injeção no fluxo de modificador, em que a amostra é injetada na porção orgânica da fase móvel (cossolvente) antes da mistura com CO₂. Isso é semelhante aos esquemas de diluição em coluna utilizados na purificação LC. A ideia é mitigar o efeito do diluente introduzindo a amostra sem afetar a força geral da fase móvel e mantendo as porcentagens de solvente programadas durante a injeção e a corrida. Nesse caso, o diluente deve coincidir com o cossolvente que está sendo utilizado para a separação; no entanto, outros diluentes podem ser empregados. A injeção no fluxo de modificador fornece uma resolução e um formato de pico aprimorados, permitindo volumes de injeção maiores e carregamento mais alto (Figura 9).

Ao utilizar a injeção no fluxo de modificador em baixas porcentagens de cossolvente, o tempo para aplicar a amostra ao cabeçote da coluna é aumentado devido à baixa taxa de fluxo da bomba de cossolvente. Devido à fase móvel altamente difusa, é possível que o aumento no tempo de injeção resulte em picos mais amplos, em comparação com as injeções de fluxo misto. No entanto, o formato de pico ainda é melhorado quando comparado com injeções de fluxo misto de alto volume em baixas porcentagens de cossolvente. Mesmo que o fluxo misto transfira a amostra para a coluna mais rapidamente, a magnitude da perturbação sob essas condições supera qualquer benefício. À medida que a porcentagem de cossolvente aumenta, a escolha da técnica de injeção se torna menos crítica, mas, em porcentagens baixas de cossolvente, o fluxo de modificador é significativamente melhor.

Detecção PDA e UV/Visível

Existem considerações específicas à SFC quando se trata de detecção óptica nesse tipo de cromatografia. As alterações na densidade da fase móvel e as diferenças nos índices de refração entre o CO₂ e o cossolvente criam deslocamento da linha de base e ruído nos detectores UV/Vis e PDA. Esses efeitos ficam especialmente acentuados sob condições de gradiente. Nos detectores PDA, a linha de base pode ser ajustada utilizando canais de comprimento de onda único e compensação de comprimento de onda que reduzem o ruído da linha de base e aumentam a sensibilidade (Figura 10). Em detectores UV/Vis, a configuração de um único comprimento de onda acentua menos o ruído e o deslocamento da linha de base.

Do ponto de vista do hardware, células de fluxo específicas foram projetadas para lidar com as altas pressões de aplicações de SFC e podem ser utilizadas nos Detectores Waters 2998 PDA e 2489 UV/Vis. As propriedades do design da célula de fluxo, incluindo o comprimento do caminho, a geometria e o material da célula, foram estudadas para otimizar a detecção em aplicações de SFC.

Detecção por MS

Uma das grandes vantagens da SFC é a capacidade de associar a seletividade de fase normal com a compatibilidade da MS. Na SFC, o CO₂ não apenas substitui solventes não compatíveis, como hexanos e heptanos, mas também, por meio da expansão de gás, ajuda na nebulização e na formação de partículas dentro da fonte de MS. A SFC é compatível com ESI, APCI e aquisição de modo duplo em uma ampla variedade de equipamentos de MS. Por sua facilidade de uso, o Detector Waters ACQUITY QDa é particularmente útil na SFC preparativa. No entanto, em baixas porcentagens de cossolvente, muitas vezes, não há íons suficientes para a detecção ideal do sinal. Devido a isso, um solvente de condicionamento (ou solvente complementar) é normalmente adicionado à separação para aumentar o sinal na MS. Um solvente de condicionamento típico contém uma mistura de metanol, água e um aditivo (geralmente hidróxido de amônio ou ácido fórmico). Muitas outras misturas de solventes de condicionamento são utilizadas, em uma variedade de taxas de fluxo, dependendo das preferências do usuário, do tipo de equipamento de MS e da escala da aplicação. Exemplos de detecção por MS-ESI em um Detector Waters ACQUITY QDa com e sem o solvente de condicionamento podem ser vistos na Figura 11.

Detecção por ELS

A SFC também é compatível com a detecção por ELS. Assim como na MS, uma separação é utilizada, e solvente complementar é adicionado para melhorar o sinal. Como a fase móvel de SFC é muito volátil, o solvente extra é necessário para transportar a amostra e obter um sinal melhor no detector ELS. Operacionalmente, o ELSD é controlado da mesma forma para a SFC que para a LC.

Coleta na SFC preparativa: Considerações sobre expansão de CO₂

As propriedades de uma fase móvel em expansão são importantes ao considerar o controle de coleta na SFC preparativa. No ponto crítico, 31 °C e 74 bar, a expansão volumétrica de CO₂ puro para as condições atmosféricas (1 bar e 15 °C) é de aproximadamente 250 vezes.

Em sistemas SFC preparativa, o CO₂ de alta pressão sai no regulador de contrapressão (BPR, Back Pressure Regulator). Essa expansão volumétrica aumenta exponencialmente, conforme a pressão do CO₂ de saída aumenta. Em sistemas binários, como a fase móvel típica da SFC, a expansão diminui à medida que a fração de CO₂ é reduzida e a porção orgânica aumenta. À medida que ocorre a expansão, a capacidade de dissolução da fase móvel é reduzida, tanto pela falta de poder de solvatação quanto pelo resfriamento de Joule-Thomson. O resfriamento também pode causar a formação de gelo seco que pode bloquear a tubulação. A falta de controle de expansão pode causar distorção dos picos no caminho do fluxo de coleta, reduzindo a pureza da fração. Isso também pode resultar em perda de recuperação, pois os compostos-alvo são varridos para o descarte ou perdidos por meio da vaporização no ponto de coleta.

Para coletar frações de maneira adequada, existem muitas estratégias utilizadas nos equipamentos de SFC para controlar a expansão de CO₂ e seus efeitos. Em primeiro lugar, para mitigar o resfriamento e os problemas associados, a fase móvel é aquecida no ponto de expansão inicial, logo após o regulador de contrapressão. Em segundo lugar, em muitos casos, um solvente orgânico complementar é adicionado, o que não apenas mantém os compostos em solução, mas também ajuda a controlar a expansão, reduzindo a fração volumétrica de CO₂. Ter um melhor controle da expansão melhora os formatos de pico após o BPR e melhora a recuperação. Por fim, o CO₂ é ventilado ou removido. Normalmente, algum tipo de dispositivo de separação de fases é utilizado para essa finalidade, como ciclones de alta pressão ou separadores de gás-líquido (GLSs, Gas-Liquid Separators) (Figura 12).

Os ciclones de alta pressão empurram a parte mais pesada (líquida) da fase móvel para o exterior e o fundo do ciclone, enquanto permitem que o gás CO₂ escape do centro e do topo. A vantagem dos ciclones de alta pressão é que eles não requerem solvente complementar (mesmo em porcentagens mais baixas de cossolvente) porque o poder de solvatação do CO₂ é mantido através da válvula de coleta, e a separação de fases ocorre nos ciclones. No entanto, também existem várias desvantagens. Os sistemas de coleta de alta pressão exigem materiais de alta pressão, como aço inoxidável, e representam um risco maior para a segurança devido à pulverização e expansão associadas à recuperação de frações. Esses sistemas também restringem o usuário a um número limitado de posições disponíveis para coleta em um formato de "leito fechado". O separador de gás-líquido (GLS) é uma opção alternativa de baixa pressão que tem muitas vantagens. Os sistemas de baixa pressão permitem a utilização de materiais com classificação de pressão mais baixa e têm um risco de segurança significativamente reduzido. E, embora seja necessário acrescentar outro solvente para a coleta, a remoção mais completa de CO₂ sob condições de baixa pressão torna a coleta em leito aberto uma realidade, aumentando consideravelmente o número de frações que podem ser coletadas e expandindo a aplicabilidade da tecnologia.

Seletividade e aplicabilidade diversas

A SFC preparativa fornece um aumento excepcional na seletividade para o processo de purificação. Embora a SFC geralmente utilize a separação de fase normal, a técnica é incrivelmente flexível porque permite a utilização de alguns solventes e colunas de RPLC convencionais, estendendo a faixa de compatibilidade do composto. A capacidade de abranger essa ampla faixa de seletividade é uma vantagem clara da SFC, pois fornece separação ortogonal dentro de uma única plataforma, agilizando todo o processo de purificação.

Compatibilidade de SFC: Solubilidade

A SFC opera, em um nível básico, em um modo de separação cromatográfica de fase normal. Em condições de corrida típicas, a maior parte da fase móvel é de CO₂ não polar associado a uma pequena fração de solvente orgânico polar, e a separação ocorre em colunas preenchidas com pequenas partículas contendo fases estacionárias relativamente polares de ampla funcionalidade. Devido à baixa viscosidade da fase móvel e às colunas de partículas pequenas, a SFC é utilizada principalmente em aplicações de moléculas pequenas. No entanto, a variedade de aplicações de maior peso molecular feitas por meio da SFC está em constante expansão. Caso contrário, a candidatura de um composto para SFC depende principalmente da solubilidade. A SFC tem uma faixa extremamente ampla de solubilidade. Na verdade, como regra geral, qualquer amostra que possa ser dissolvida em um solvente orgânico é candidata à SFC. Isso é muito útil, porque muitas técnicas de preparo de amostras resultam em amostras dissolvidas em solventes orgânicos, que podem ser injetadas diretamente nos equipamentos de SFC preparativa.

Uma informação útil sobre a solubilidade de um composto em solventes orgânicos refere-se ao coeficiente de partição, normalmente designado como LogP. Geralmente, o LogP é uma medida da lipofilicidade ou hidrofobicidade de um composto. Especificamente, é a razão de concentração de um composto nas duas fases de uma mistura de dois solventes imiscíveis em equilíbrio; geralmente água e 1-octanol. Como o CO₂ é um solvente não polar, os valores de LogP são um bom indicador de como um composto se comportará sob condições de SFC. Valores baixos de LogP indicam polaridade mais alta, cujo resultado é menos solubilidade em CO₂ e mais afinidade para os recheios de coluna polares, enquanto valores altos de LogP indicam baixa polaridade, resultando em mais solubilidade de CO₂ e menos afinidade para a coluna. O oposto disso acontece na cromatografia líquida de fase reversa (RPLC, Reversed-Phase Liquid Chromatography), em que a fase móvel é polar e a fase estacionária é apolar.

Em aplicações analíticas (UPC²), um carregamento menor e amostras menos concentradas podem acomodar compostos com valores de LogP entre -2 e 9. Entretanto, na SFC preparativa, é importante que os compostos permaneçam em solução quando introduzidos no CO₂ sob condições de alto carregamento. As amostras que contêm compostos muito polares ou hidrofílicos em concentrações e quantidades preparativas devem ser testadas quanto à solubilidade, antes da injeção no sistema. Normalmente, isso é feito dissolvendo a amostra em um solvente orgânico adequado, seguido pela introdução de uma pequena quantidade de hexano ou heptano. Se a amostra precipitar fora da solução, ela geralmente é considerada inadequada para a SFC preparativa.

Uma desvantagem da SFC preparativa é a baixa solubilidade de compostos altamente polares. No entanto, com a adição de uma pequena quantidade de água (como aditivo, geralmente inferior a 5% v:v) à porção orgânica da fase móvel, a SFC pode ser utilizada para uma faixa ainda mais ampla de polaridade da amostra. A água aumenta a solubilidade de compostos hidrofílicos, possibilitando a separação e purificação desses compostos. Desse modo, o escopo de aplicabilidade da SFC pode ser estendido para o estudo de peptídeos, proteínas, nucleobases e outros analitos hidrofílicos. Embora essa técnica tenha sido comprovada para ajudar em aplicações polares, ela deve ser abordada com cuidado na SFC preparativa para evitar a precipitação da amostra ou a formação de gelo na saída do sistema.

Aplicabilidade da SFC: Cossolventes

A seleção de cossolvente é um parâmetro-chave na SFC para desenvolvimento e otimização de métodos cromatográficos. Na cromatografia líquida de fase normal e na de fase reversa, existem restrições à miscibilidade do solvente. Os hidrocarbonetos alifáticos na fase normal e a água na fase reversa limitam a faixa de polaridade dos solventes que podem ser utilizados nessas separações. Na SFC, o CO₂ supercrítico é miscível com solventes orgânicos de fase reversa e de fase normal, de metanol a heptanos, abrindo uma ampla variedade de opções de seletividade de solvente para desenvolver uma separação. Essa ampla faixa de seletividade aumenta muito a variedade de aplicações compatíveis com SFC.

Aplicabilidade da SFC: Colunas

Na cromatografia de fase reversa, a maioria das separações é realizada em um número limitado de fases estacionárias, normalmente C₁₈ ou colunas hidrofóbicas semelhantes. Uma grande variedade de recheios de coluna quirais e aquirais que abrangem os intervalos de fase reversa (não polar) e de fase normal (polar) são aplicáveis na SFC. Os compostos básicos, neutros e ácidos são bem eluídos na maioria das colunas, indicando a adequação da SFC preparativa para uma ampla variedade de funções químicas. A utilização de uma variedade de colunas pode ser vista como uma desvantagem; no entanto, também é uma oportunidade de otimizar a seletividade para purificar um composto específico. As fases estacionárias modernas de SFC preparativa fornecem um potencial adicional para maior utilização de SFC para purificação quiral e aquiral. Em particular, as Colunas Waters Viridis e Torus foram projetadas especificamente para a aplicação de SFC, oferecendo melhor estabilidade, uma ampla faixa de seletividade e melhor formato de pico, o que reduz a necessidade de aditivos. A Tabela 4 mostra uma lista de colunas da Waters que abrangem o intervalo de aplicabilidade da SFC preparativa. A seleção de colunas é um parâmetro-chave no desenvolvimento e na otimização de métodos.

Separação quiral

A SFC é, de longe, a melhor solução cromatográfica para separar compostos quirais, proporcionando melhorias consideráveis na eficiência e na velocidade de separação em comparação com outras técnicas cromatográficas, como HPLC de fase normal. As separações quirais são normalmente obtidas utilizando HPLC de fase normal. Na SFC, essas separações são feitas em muito menos tempo, ao mesmo tempo que aumentam a resolução e reduzem o consumo de solvente.

Portanto, as colunas quirais são muito utilizadas no ambiente de SFC, não apenas para aplicações quirais, mas também para a separação de diastereômeros, metabólitos, regioisômeros e outros compostos relacionados estruturalmente. Embora as fases baseadas em celulose e amilose sejam as mais populares, outras fases estacionárias quirais também são compatíveis. Isso apresenta vantagens na purificação desses compostos, como frações de maior pureza, maior eficiência e economia de custos devido à redução na utilização de solvente. A Figura 13 mostra a separação quiral dos enantiômeros e diastereômeros de permetrina utilizando SFC e HPLC de fase normal.

Todos os quatro picos não puderam ser resolvidos usando a HPLC; no entanto, eles foram resolvidos em menos tempo e utilizando uma coluna mais curta por meio da SFC.