Guia para iniciantes em SFC preparativa

Screening de coluna

Antes que um composto-alvo possa ser isolado cromatograficamente, é necessário realizar o desenvolvimento de métodos. Normalmente, isso é feito na escala analítica para economizar solvente, tempo e amostra. Na SFC (Supercritical Fluid Chromatography, cromatografia de fluido supercrítico), a retenção de componentes individuais de uma mistura em uma fase estacionária definida não pode ser prevista. Ao contrário da RPLC (Reversed-Phase Liquid Chromatography, cromatografia líquida de fase reversa), a identificação do recheio certo da coluna é crítica para separações por SFC e é o fator mais importante no desenvolvimento de métodos por SFC. Portanto, é importante contar com uma estratégia de screening eficiente para maximizar a qualidade da separação em relação ao(s) destino(s) da purificação. O desenvolvimento da fase estacionária é atualmente muito dinâmico, e um pequeno número de recheios poderia emergir como as colunas preferenciais no futuro. Atualmente, a maioria dos usuários adapta um processo de screening automatizado utilizando as "melhores" colunas para sua aplicação.

Vários fatores precisam ser considerados para determinar um conjunto apropriado de colunas para screening. O L/dp (comprimento/tamanho de partícula) precisa ser mantido entre a coluna analítica e a coluna preparativa eventual, então, apenas colunas analíticas de tamanho adequado devem ser consideradas. Isso garante a continuidade da cromatografia entre os sistemas em aumento de escala. As colunas devem ter uma ampla faixa de seletividade e também ser apropriadas para a natureza da amostra. Por exemplo, compostos altamente polares (como carboidratos) não são suscetíveis a reter em uma coluna C₁₈, enquanto uma coluna de sílica provavelmente não é ideal para compostos extremamente hidrofóbicos (não polares) (como a maioria dos carotenoides). As colunas também podem ser classificadas de acordo com sua adequação para compostos básicos ou ácidos, ou ambos.

Para a purificação quiral, colunas quirais são necessárias. Devido à interação mais complexa de fase estacionária com compostos-alvo, é necessário fazer mais métodos de tentativa e erro para determinar a melhor coluna para separações quirais. No entanto, algumas colunas têm uma taxa de acerto mais alta do que outras. Por exemplo, as fases quirais derivadas de celulose e amilose são populares por sua ampla aplicabilidade, enquanto outras fases quirais, como as fases do tipo pirkle, são populares por sua alta estabilidade química. As fases quirais também podem ser utilizadas com sucesso para aplicações aquirais, especialmente com isômeros posicionais ou compostos intimamente relacionados.

O screening de coluna normalmente é feito utilizando condições de solvente de gradiente, normalmente entre 2% e 50% de cossolvente. Essas condições fornecem ao usuário uma boa ideia de qual coluna será a ideal para isolar o composto-alvo, enquanto também fornecem uma boa indicação de quais porcentagens de cossolvente são necessárias para a eluição do composto. A Figura 14 é um exemplo de screening de coluna quiral para a separação de (R) e (S)-goitrina (um produto natural ativo encontrado na raiz de Isatis Indigotica Fort), utilizando cinco fases estacionárias baseadas em celulose e amilose (IC, OJ-H, AS-H, OD-H e AD-H), e uma fase estacionária do tipo pirkle (S,S)-Whelk-O1.16. Um exemplo de screening de coluna aquiral pode ser visto na Figura 15, onde uma mistura de três carotenoides passa por screening em quatro fases estacionárias aquirais.17 Observe que os carotenoides são melhor retidos na C₁₈, e não nas outras fases mais polares.

Screening de solvente

O CO₂ sozinho geralmente é insuficiente para a eluição de compostos de uma coluna cromatográfica; assim, um cossolvente polar é normalmente adicionado. A seleção de cossolvente é um parâmetro-chave na SFC para desenvolvimento e otimização de métodos cromatográficos. Para a maioria das aplicações, uma ampla variedade de cossolventes e misturas pode ser aplicada para otimizar a separação. A variedade de solventes compatíveis na SFC pode parecer excessiva; no entanto, ela pode ser simplificada pelo pareamento de ambas as extremidades do espectro de polaridade; o CO₂ não polar com solventes orgânicos altamente polares, resultando em uma fase móvel que cobre uma grande variedade de força do solvente.

Os quatro cossolventes mais utilizados normalmente são metanol, etanol, isopropanol e acetonitrila; sendo o metanol o mais forte, e a acetonitrila o mais fraco em polaridade. Normalmente, o metanol ou o etanol são recomendados para o screening de coluna e o screening inicial de solvente. O isopropanol e a acetonitrila são boas opções para otimizar o método ou nos casos em que o etanol ou o metanol não resultam em uma resolução aceitável. Muitas vezes, as combinações desses solventes podem ajustar a polaridade da fase móvel. Por exemplo, adicionar acetonitrila ao etanol enfraquece o cossolvente, aumentando a retenção e proporcionando uma seletividade diferente. Normalmente, à medida que a força do cossolvente diminui, a retenção aumenta. Além disso, assim como na LC, conforme a proporção de solvente forte aumenta, a retenção diminui (Figura 16). Às vezes, no entanto, devido à baixa viscosidade do CO₂, a taxa de fluxo total pode ser aumentada (na mesma porcentagem de cossolvente), resultando em um tempo de corrida menor e, ao mesmo tempo, mantendo a separação (Figura 17).

Aditivos no cossolvente

Picos mais finos e resolução aprimorada são importantes na cromatografia preparativa, em que picos amplos e baixa solubilidade podem ter resultados desastrosos para a produtividade. A assimetria de pico na SFC pode ser suprimida com a utilização de aditivos na porção de cossolvente da fase móvel, o que estende o intervalo de solutos passíveis de uma fase móvel à base de CO₂.

A utilização de CO₂ como solvente cromatográfico resulta em uma fase móvel levemente ácida quando combinada com outros solventes orgânicos polares. Como uma fase móvel à base de CO₂ é levemente ácida, muitos compostos ácidos e neutros exibem formatos de pico aceitáveis sem a necessidade de um aditivo de fase móvel. No entanto, os aditivos ácidos podem melhorar os formatos de pico de alguns compostos ácidos (Figura 18). Aditivos ácidos comuns incluem ácido trifluoroacético, ácido fórmico e ácido acético. Aplicações contendo compostos básicos normalmente requerem um aditivo básico (normalmente entre 0,1 e 1%) para melhorar a cromatografia (Figura 19). Aditivos básicos comuns são aminas secundárias ou terciárias, como isopropilamina (IPA), dietilamina (DEA) ou trietilamina (TEA). Esses aditivos são extremamente eficazes mesmo em concentrações muito baixas (níveis baixos de até 0,01% no cossolvente); no entanto, eles podem interferir na detecção por MS e podem apresentar efeitos de memória em alguns recheios de coluna (especificamente sílica nua). Como resultado, o acetato de amônio e o hidróxido de amônio também são utilizados, uma vez que são mais compatíveis com a MS e a coluna e podem até melhorar o sinal da MS.

Além dos cossolventes clássicos, muitas colunas novas são compatíveis com cossolventes ou aditivos não clássicos, incluindo acetato de etila, tetrahidrofurano, diclorometano, clorofórmio ou dimetoximetano. Essas combinações permitem que os tempos de retenção e a seletividade sejam modulados ainda mais, enquanto melhoram a solubilidade da amostra. Um aditivo não clássico que está ganhando popularidade é a água. A água é imiscível com CO₂; no entanto, quando utilizada como um aditivo em um cossolvente fortemente polar (como o metanol), a água torna-se uma excelente escolha para aumentar a solubilidade e o formato de pico de compostos hidrofílicos em SFC. A quantidade de água que pode ser tolerada depende da proporção do cossolvente na fase móvel total. Eventualmente, o ruído da linha de base será observado devido à separação de fases (imiscibilidade) na fase móvel. Normalmente, 1% a 5% de água podem ser utilizados efetivamente no cossolvente polar. Com água como aditivo, os compostos polares mais fortes podem ser purificados pela cromatografia de fluido supercrítico preparativa (SFC preparativa).

Para fins de purificação, é melhor evitar a utilização de aditivos que precisarão ser removidos a jusante. Se forem necessários aditivos para a separação, aditivos voláteis que possam ser facilmente removidos devem ser utilizados na menor concentração efetiva. Como alternativa, agora existem novas fases estacionárias que reduzem a necessidade de aditivos em conjunto, o que proporciona um benefício significativo para a SFC preparativa.

A solubilidade e o fator de retenção de todos os compostos estão estreitamente relacionados à densidade do fluido.

A densidade da fase móvel ao longo da coluna é de grande importância porque controla as propriedades físicas e químicas da fase móvel. Uma característica interessante da SFC é a capacidade de controlar a densidade da fase móvel utilizando temperatura e pressão. Embora a escolha da coluna e da fase móvel tenha o maior impacto na separação em SFC, a temperatura e a pressão são utilizadas para ajustar ou otimizar uma separação. Entre os dois parâmetros, a pressão tem a maior influência na cromatografia; conforme a pressão aumenta, a densidade aumenta, normalmente resultando em um tempo de retenção e em uma resolução reduzidos (Figura 20). Por outro lado, temperaturas mais altas resultam em menor densidade e tempos de retenção mais longos. Entretanto, com a temperatura, o efeito depende do composto e pode resultar em uma alteração na resolução, ou mesmo na ordem de eluição para compostos de eluição próximos; isso foi observado com mais frequência para separações quirais (Figura 21).

A pressão é controlada utilizando um regulador de contrapressão (BPR, Back Pressure Regulator) que define a "contrapressão" do sistema após a coluna. Embora os sistemas sejam projetados para uma ampla faixa de pressões (pontos de ajuste de até 400 bar), na SFC preparativa, o regulador de contrapressão é normalmente ajustado entre 100 e 200 bar (1450 a 2901 psi). As temperaturas são controladas por pontos de ajuste utilizando um forno (aquecendo a coluna) ou trocadores de calor (aquecendo a fase móvel).

Os pontos de ajuste de temperatura típicos estão entre 40 e 60 °C. Algumas aplicações são executadas em condições subcríticas (CO₂ líquido), em que as temperaturas são definidas mais baixas entre 25 e 35 °C, enquanto a pressão é mantida relativamente alta. Não é recomendado executar aplicações em pressões e temperaturas próximas ao ponto crítico porque, nessas condições, pequenas alterações na temperatura ou pressão resultam em grandes alterações na densidade (e na cromatografia). As limitações de temperatura e pressão estão normalmente relacionadas à robustez do recheio ou do preenchimento da coluna.

Otimização das condições da fase móvel

A escolha da combinação ideal de solvente e coluna geralmente é específica à aplicação ou ao objetivo. Em um cenário perfeito, alto carregamento, boa resolução e separação rápida se combinam para fornecer recuperação completa do destino em alta pureza. Na realidade, porém, geralmente é necessário fazer concessões para determinar a solução mais produtiva. Por exemplo, os picos podem ser bem separados (permitindo alto carregamento), mas exigem um tempo de corrida mais longo. Por outro lado, uma boa separação com um tempo de corrida significativamente mais curto permitiria um tempo de ciclo menor, mas possivelmente com um carregamento menor. Outra consideração é o processamento ou a recuperação de fração a jusante, em que a quantidade ou o tipo de solvente podem ser fatores importantes. Por fim, se a separação puder ser realizada em condições isocráticas, injeções empilhadas poderão ser utilizadas, melhorando muito a produtividade. Uma vez que a coluna e o solvente são selecionados, outros parâmetros podem ser manipulados para otimizar melhor a separação antes do aumento de escala e da purificação.

Otimização das condições de gradiente: Na SFC, os gradientes focados não funcionam da mesma forma que na RPLC. Devido aos muitos mecanismos de retenção concorrentes na cromatografia de fase normal, as alterações no gradiente podem ter efeitos díspares na retenção de diferentes analitos. Especificamente na SFC, há também uma mudança na densidade e na queda de pressão que acompanha o aumento do cossolvente ao longo do gradiente. À medida que a quantidade de cossolvente aumenta, o efeito no tempo de retenção não é linear, tornando difícil prever a seletividade dos compostos com as mudanças nas condições. Para compostos estruturalmente semelhantes, isso é menos problemático, pois eles seguem mecanismos de retenção semelhantes. As amostras que contêm misturas de compostos que são estruturalmente diferentes (em uma matriz, por exemplo) apresentam um desafio maior. Em geral, no entanto, gradientes mais superficiais resultam em tempos de retenção mais longos e melhor resolução.

Determinação das condições isocráticas: Os métodos isocráticos são ideais porque são fáceis de desenvolver com base nos resultados do screening e podem ser utilizadas injeções empilhadas, melhorando a produtividade. Utilizando o tempo de retenção, a inclinação do gradiente de screening e a compensação do atraso do volume da coluna e do sistema, as porcentagens de cossolvente na eluição podem ser determinadas. Na SFC, normalmente o melhor ponto de partida para a otimização é 5% abaixo da porcentagem calculada.

O gradiente de screening foi de 2 a 20% ao longo de 5 minutos, e o atraso do gradiente foi de 0,46 min (previamente determinado). Assim, com uma inclinação calculada de 3,6%/min e 2% de porcentagem inicial, a porcentagem de cossolvente na eluição do primeiro pico em 4,12 minutos foi calculada utilizando a seguinte equação:

■% de cossolvente na eluição = (tempo de retenção - atraso do gradiente) x inclinação do gradiente +% inicial

■% de cossolvente na eluição = (4,12 min – 0,46 min) x 3,6%/min + 2%

■% de cossolvente na eluição = 15%

Portanto, após subtrair 5%, as condições de 10% de cossolvente isocrático foram utilizadas como ponto de partida para a otimização. A cromatografia resultante mostrou boa separação; mas, ao aumentar a fração de cossolvente da fase móvel de volta para 15%, os picos ainda foram bem resolvidos com um tempo de corrida mais curto. Nesse caso, o método de 10% permitiria um carregamento maior, enquanto o método de 15% permitiria tempos de ciclo menores.

Escala de sistema

Para SFC preparativa, os equipamentos com capacidade para operar em taxas de fluxo de 2 mL/min a várias centenas de mL/min estão disponíveis para atender aos requisitos necessários para trabalhar em várias escalas. Em uma rotina de trabalho adequada, a escala da purificação precisa corresponder ao objetivo da aplicação. Isso é especialmente importante quando a amostra é limitada ou tem baixa solubilidade. Nessa situação, um sistema de purificação em escala menor (semipreparativo) é mais prático. Na SFC, as purificações em pequena escala são normalmente realizadas em colunas com 4,6 mm a 10 mm de diâmetro interno, a taxas de fluxo de 3 a 20 mL/min. Uma tabela que corresponde ao tamanho da coluna com as taxas de fluxo e a capacidade de carregamento aproximada na SFC preparativa é mostrada abaixo (Tabela 5). É importante observar que a capacidade de carregamento de uma amostra específica depende de muitos fatores, incluindo solubilidade, resolução do destino e a quantidade relativa do composto-alvo na matriz.

Os sistemas SFC preparativa em escala maior utilizam colunas de diâmetro interno de 18 a 50 mm a taxas de fluxo de 50 a 350 mL/min. A maior capacidade da coluna permite mais carregamento por injeção e taxas de fluxo mais altas, o que otimiza o rendimento para essas aplicações. No mundo global da purificação, esses sistemas são considerados de escala média. Sistemas SFC preparativa em grande escala piloto (não abordados aqui) são utilizados em muitos processos industriais estabelecidos. Eles utilizam colunas de cromatografia de compressão axial dinâmica (DAC, Dynamic Axial Compression) de alta pressão (30 cm de diâmetro interno ou maior) e normalmente são operados como instalações da fábrica.

Rotinas de trabalho: “em massa” ou “em lote”

Dependendo da aplicação, existem duas rotinas de trabalho básicas utilizadas na SFC preparativa. A primeira é chamada de purificação "em massa". Nessa rotina de trabalho, uma única amostra de grande quantidade é injetada várias vezes até que a quantidade necessária do(s) destino(s) seja recuperada ou a amostra se esgote. Todas as frações coletadas correspondentes são agrupadas em um de um número limitado de frascos de coleta. Quantidades "em massa" de material são processadas e recuperadas ao longo de várias horas (ou, às vezes, até dias). Normalmente, essa é a purificação direcionada por UV, embora outros métodos de detecção possam ser utilizados. Nesse caso, normalmente as amostras são bem caracterizadas e compreendidas, e a alta produtividade é o objetivo.

Para muitas aplicações "em massa", são utilizadas injeções empilhadas. As injeções empilhadas melhoram significativamente o rendimento utilizando todo o espaço cromatográfico disponível para separação e purificação contínuas. Basicamente, as injeções empilhadas reduzem o tempo entre os ciclos de injeção e minimizam ainda mais a utilização de solvente. Um exemplo de injeções empilhadas pode ser visto na Figura 22. Em algumas aplicações, várias injeções podem ser feitas antes que o primeiro conjunto de picos tenha eluído. Para que as injeções empilhadas sejam utilizadas, o sistema deve ser capaz de fazer as injeções enquanto as coletas estão ocorrendo. Portanto, utiliza-se um módulo de injeção separado ou um sistema capaz de movimento autônomo das unidades de coleta e injeção (agulhas e probes).

A purificação "em lote" refere-se a uma rotina de trabalho que é mais prática para a purificação da biblioteca ou quando há várias amostras com vários destinos que precisam ser purificados. Normalmente, a purificação direcionada por massa é utilizada porque é mais seletiva na coleta de frações. Com a purificação direcionada óptica (ou UV), os picos não podem ser distinguidos uns dos outros pelo detector. Muitos compostos são absorvidos no mesmo comprimento de onda. A purificação direcionada por massa coleta frações com base na massa, que é um parâmetro muito mais específico porque distingue entre o(s) alvo(s) e quaisquer impurezas. Isso é especialmente útil quando as amostras têm matrizes complexas, não são bem caracterizadas ou não podem ser detectadas por UV porque não têm cromóforos. Normalmente, os métodos de gradiente são utilizados para melhorar o formato de pico e separar melhor os compostos de interferências complexas. Essa rotina de trabalho utiliza coleta de leito aberto em vários tubos; normalmente, cada tubo constitui uma única fração. As amostras são executadas como um "lote" e os compostos-alvo são coletados com base em suas massas. A purificação em lote também pode ser feita por meio de gatilhos somente UV ou UV e MS. Um exemplo de purificação baseada em MS de compostos-alvo provenientes de produtos naturais pode ser visto na Figura 23.