Guia para iniciantes em UPLC

Se pensarmos na resolução cromatográfica no sentido mais básico, é simplesmente a largura (w) de dois picos em relação à distância (t_R,2–t_R,1) entre esses picos. Se pudermos estreitar ou afastar esses picos, poderemos melhorar a resolução.

A resolução pode ser expressa matematicamente em termos mais relevantes na forma da equação de resolução fundamental. A equação de resolução é composta por parâmetros físicos e químicos que afetam a resolução cromatográfica; eficiência (N), seletividade (α) e capacidade de retenção (k). Seletividade e capacidade de retenção são fatores químicos que têm sido historicamente mais fáceis de manipular para melhorar a resolução. Esses parâmetros podem ser afetados por alterações como temperatura, solvente de eluição, composição da fase móvel e recheio da coluna. A eficiência é um parâmetro físico (mecânico) que é mais difícil de manipular devido à influência de sua raiz quadrada na resolução. No entanto, a eficiência pode ter um impacto significativo na resolução se o tamanho da partícula for muito pequeno. A tecnologia UPLC se concentra em melhorar a resolução utilizando partículas inferiores a 2 µm para melhorar a eficiência do sistema.

É mais fácil entender como esses parâmetros afetam a resolução se pensarmos sobre como esses três termos são representados cromatograficamente (Figura 15). A capacidade de retenção (k) e a seletividade (α) são fatores químicos que movem os picos um em relação ao outro e são uma medida da interação dos analitos com a fase estacionária e a fase móvel. Podemos melhorar a resolução aumentando k. No entanto, isso resulta em tempos de retenção mais longos, menor sensibilidade e larguras de pico mais amplas. Um aumento em α pode resultar em mais resolução, na mesma ordem de eluição de pico em um período de tempo semelhante e/ou em uma alteração na ordem de eluição. A eficiência (N) é uma medida física de expansão de faixa em uma separação. Supondo que N seja melhorado pela redução do tamanho da partícula do material de retenção, a distância entre os centros dos picos não muda. Além disso, uma redução no tamanho da partícula resultará em picos cromatográficos mais estreitos e eficientes, melhorando, assim, a resolução e a sensibilidade.

A relação entre resolução, eficiência e tamanho de partícula

A tecnologia UPLC maximiza a contribuição física (mecânica) para a resolução minimizando a expansão de faixa do equipamento, permitindo a utilização de colunas de partículas menores e de maior eficiência (1,7 µm a 1,8 µm). Com exemplos cromatográficos simples e aritmética básica, é possível obter um melhor entendimento dos princípios cromatográficos por trás da tecnologia UPLC.

Conforme definido na equação de resolução fundamental, a resolução é diretamente proporcional à raiz quadrada da eficiência.

Além disso, a eficiência é inversamente proporcional ao tamanho da partícula. Isso significa que, se o tamanho da partícula do material de retenção diminuir, a eficiência de separação aumentará. Por exemplo, se o tamanho da partícula do material de retenção é reduzido de 5 µm para 1,7 µm (3X), a teoria prevê que a eficiência deve aumentar 3X, resultando em um aumento de 1,7X na resolução (raiz quadrada de 3).

Para atingir os ganhos de eficiência e resolução previstos pela teoria, a taxa de fluxo ideal deve ser executada em relação ao tamanho da partícula. A taxa de fluxo ideal (F_opt) é inversamente proporcional ao tamanho da partícula. Isso significa que, se o tamanho da partícula for reduzido de 5 µm para 1,7 µm (3X), a taxa de fluxo ideal para executar essa partícula aumentará 3X, resultando em uma redução no tempo de análise para o mesmo grau (3X), aumentando, assim, o rendimento da amostra.

Uma das primeiras coisas que observamos como cientistas é o que acontece quando a taxa de fluxo cromatográfica é alterada. Se a taxa de fluxo aumentar, o tempo de corrida analítica diminuirá. Além disso, a largura do pico também diminui. À medida que a largura do pico se torna mais estreita, a altura desse pico aumenta proporcionalmente. Picos mais estreitos que são mais altos, são mais fáceis de detectar e diferenciar do ruído da linha de base (S/R mais alto), resultando em maior sensibilidade.

Esses princípios teóricos foram aplicados cromatograficamente. Conforme observado na Figura 20, quando a expansão de faixa extracoluna é minimizada, como no Equipamento ACQUITY UPLC, o desempenho teórico de uma coluna pode ser alcançado.

A discussão anterior demonstra a importância da expansão de faixa intracoluna. Se entendermos melhor quais processos influenciam a expansão de faixa e como reduzi-la, será possível obter melhorias na eficiência e, portanto, na resolução.

Noções básicas das curvas de van Deemter

Conforme descrito anteriormente, a largura de um pico pode ser considerada como uma distribuição estatística das moléculas do analito (variância, σ²). A largura do pico aumenta linearmente em proporção à distância em que esse pico se deslocou. A relação entre a largura do pico e a distância na qual esse pico se deslocou é um conceito chamado de altura equivalente a uma placa teórica (HETP ou H, Height Equivalent to a Theoretical Plate). Originário da teoria da destilação, H é uma medição do desempenho da coluna que leva em consideração vários processos relacionados à expansão de faixa. Para colocar isso em termos que possam ser mais familiares, quanto menor o HETP, mais placas (N) há em uma coluna (Figura 21).

Se pensarmos sobre o que está ocorrendo em um nível molecular dentro de uma coluna (como as moléculas do analito estão interagindo com a fase móvel e a fase estacionária), podemos entender melhor os diferentes processos relacionados à difusão que estão ocorrendo e que contribuem para o desempenho cromatográfico (Figura 22).

Existem vários processos relacionados à difusão ocorrendo simultaneamente:

1. Moléculas de analito são transportadas para a superfície da partícula e ao redor dessa partícula (difusão turbulenta)
2. As moléculas do analito estão se difundindo para frente e para trás na fase móvel em massa (difusão longitudinal)
3. As moléculas do analito estão se difundindo para dentro e para fora dos poros cromatográficos (transferência de massa).

Esses processos relacionados à difusão podem ser expressos matematicamente na forma da equação de van Deemter.

A equação de van Deemter é composta por três termos:

• O termo A (difusão turbulenta) está relacionado principalmente ao tamanho da partícula do material de retenção. Seu valor também é determinado pela qualidade do preenchimento do leito cromatográfico. Também está relacionado à uniformidade ou não uniformidade do fluxo para e ao redor de uma partícula.
• O termo B (difusão longitudinal) está relacionado à difusão do analito na fase móvel em massa e na fase estacionária e diminui com o aumento da velocidade da fase móvel (velocidade linear).
• O termo C (transferência de massa) está relacionado à velocidade linear (a velocidade da fase móvel) e ao quadrado do tamanho da partícula. A transferência de massa é a interação das moléculas do analito com a superfície interna da fase estacionária e sua distância de difusão para dentro e para fora dos poros do material de retenção.

Podemos observar esses termos individualmente representando-os em gráfico em uma escala de HETP em relação à velocidade linear (u) da fase móvel (Figura 24).

O termo A é representado em gráfico como uma linha horizontal. Ele está relacionado ao tamanho da partícula e à qualidade do preenchimento de uma coluna, e é independente da velocidade linear (velocidade da fase móvel). À medida que o tamanho da partícula do material de retenção diminui, o valor de H também diminui (maior eficiência).

O termo B é representado em gráfico como uma curva inclinada para baixo com velocidade linear crescente. Esse termo é independente do tamanho da partícula e indica que, se a fase móvel se mover a uma velocidade linear mais lenta, as moléculas do analito permanecerão na coluna por um tempo maior e, portanto, haverá uma maior oportunidade de expansão de faixa (difusão) no sentido do comprimento dentro da coluna. Inversamente, se a fase móvel se mover a uma velocidade linear mais rápida, haverá menos tempo para a difusão e, portanto, menos tempo para que ocorra a expansão de faixa.

O termo C é representado em gráfico como uma relação linear crescente entre H e u. Entre uma distribuição de moléculas, algumas moléculas entram em um poro de fase estacionária, enquanto outras permanecem na fase móvel em movimento até que atinjam outra partícula. Isso é seguido pelo processo reverso, em que as moléculas imobilizadas se destacam e se movem para baixo no leito cromatográfico. Leva tempo para uma molécula entrar e sair dos poros e, portanto, conforme as moléculas são transferidas de uma partícula para a próxima, a faixa de analito que contém essas moléculas se alarga conforme se move ao longo do comprimento da coluna. Quanto menores as partículas da fase estacionária, mais rápido esse processo ocorre, evitando que a faixa de analito se expanda. Se a fase móvel se move rapidamente, uma distância maior se desenvolve entre as moléculas imobilizadas e as que se movem adiante. Isso indica que, para que a população de moléculas de analito permaneça junta, a fase móvel deve se mover a uma velocidade linear mais lenta. À medida que a velocidade da fase móvel é aumentada, a população de moléculas de analito se torna mais dispersa, resultando em maior expansão de faixa.

Uma curva de van Deemter é formada ao adicionar os termos A, B e C (Figura 25). Realizar uma separação na velocidade linear em que ocorre o ponto mais baixo da curva resultará na maior eficiência e, portanto, na resolução cromatográfica.

Se correlacionarmos isso com a equação de van Deemter mostrada na Figura 23, se o tamanho da partícula for reduzido pela metade, H é reduzido por um fator de 2. Portanto, é possível reduzir a expansão de faixa dentro de uma coluna utilizando partículas menores.

Por exemplo, a Figura 26 mostra um gráfico de van Deemter de uma partícula de 10 µm e uma de 5 µm. Como observado no gráfico, uma partícula grande de 10 µm tem um intervalo de operação ideal muito estreito com relação à velocidade linear, para atingir o valor de H mais baixo (18 µm a 0,7 mm/s). Se a velocidade da fase móvel for muito lenta ou muito rápida, um aumento em H (perda de eficiência) é observado, reduzindo, assim, a resolução cromatográfica e a sensibilidade. No entanto, a partícula de 5 µm exibe um valor de H muito mais baixo, (10 µm a 0,95 mm/s; maior eficiência) em uma velocidade de fase móvel mais alta, bem como em um intervalo de velocidade linear maior no qual esse valor de H pode ser alcançado. Isso significa que uma maior eficiência e, portanto, resolução, pode ser alcançada em um tempo menor do que com uma coluna preenchida com partículas maiores de 10 µm.

Para obter uma compreensão adicional desse efeito, podemos investigar mais a fundo a influência do tamanho da partícula nos termos individuais da equação de van Deemter.

O tamanho da partícula tem um impacto significativo na faixa de analito no que se refere ao termo A (difusão turbulenta). O caminho que as moléculas do analito percorrem para transferir da fase móvel em massa para a superfície da partícula e ao redor dessa partícula leva menos tempo conforme o tamanho da partícula é reduzido. Partículas maiores fazem com que as moléculas do analito se desloquem por caminhos mais longos e indiretos. As diferenças nesses caminhos resultam em tempos de migração diferentes para as moléculas de analito dentro de uma população, resultando em uma faixa de analito mais ampla e no pico resultante. À medida que o tamanho da partícula do preenchimento é diminuído, os caminhos das moléculas do analito tendem a ser mais semelhantes em comprimento. Isso resulta em faixas de analito mais estreitas que se traduzem em picos mais estreitos, maior eficiência e maior sensibilidade (Figura 27).

A difusão longitudinal, o termo B, não é afetada diretamente pelo tamanho da partícula. No entanto, conforme o tamanho da partícula diminui, os outros parâmetros da equação de van Deemter, os termos A e C, ficam menores. Consequentemente, a velocidade linear ideal (velocidade de fase móvel) aumenta, resultando em menos oportunidade para expansão de faixa. A velocidade linear mais lenta permite que a faixa de moléculas do analito interaja com o material de retenção por um período de tempo mais longo. Isso significa que há mais tempo para a difusão axial (no sentido do comprimento) na fase móvel, resultando em faixas de analitos mais amplas e difusas. Em velocidade linear mais alta, a população de moléculas de analito é varrida através da coluna em um período de tempo mais curto, o que permite que a faixa de analito permaneça mais concentrada, resultando em picos de eficiência mais estreitos e mais altos devido ao menor tempo para difusão longitudinal (Figura 28).

O termo C (transferência de massa) é afetado pela velocidade linear e pelo tamanho da partícula. As populações de moléculas de analito são transportadas da fase móvel para a superfície da partícula. As moléculas de analito movem-se então através da fase móvel nos poros para a camada de superfície ligada (por exemplo, C₁₈, C₈, etc.), interagem com a fase ligada e, em seguida, são varridas de volta para fora do poro para a fase móvel em massa. No entanto, as moléculas de analito dentro da população se deslocam para dentro e para fora do poro em vários graus. Isso significa que, à medida que as moléculas retornam à fase móvel em massa, o comprimento do caminho no qual cada molécula de analito se deslocou é diferente, resultando em uma expansão (alargamento) da faixa de analito (Figura 29). A quantidade de expansão de faixa que ocorre dependerá da velocidade da fase móvel (Figura 30).

Em uma velocidade linear alta, o tempo entre as moléculas que interagem com a superfície da partícula e se transferem através da fase móvel é maior. Quanto mais rápida a velocidade da fase móvel, mais rápido as moléculas do analito se moverão através da coluna, resultando em uma faixa de analito mais ampla e menos concentrada. Isso se traduz em um pico cromatográfico mais amplo e menor sensibilidade.

Em uma velocidade linear lenta, o comprimento das etapas entre as interações com a superfície é menor. Isso resulta em uma faixa de analito mais concentrada, produzindo picos cromatográficos mais estreitos e mais eficientes.

A transferência de massa melhora drasticamente à medida que o tamanho da partícula diminui devido à sua relação com o quadrado do tamanho da partícula (d_p²). Para partículas menores, leva menos tempo para uma molécula de analito se deslocar para os poros, interagir com a superfície cromatográfica e ser varrida de volta para a fase móvel. Portanto, as moléculas de analito separadas em colunas de partículas menores se difundem muito mais rapidamente, resultando em uma faixa cromatográfica mais nítida, estreita e eficiente (Figura 31).

Reduzir o tamanho da partícula, portanto, melhorará a transferência de massa, diminuindo, assim, efetivamente a inclinação do termo C, o que nos leva aonde estamos hoje com a tecnologia UPLC. Como pode ser visto no gráfico de van Deemter na Figura 32, partículas de 1,7 µm fornecem valores de HETP 2-3X mais baixos do que partículas de 3,5 µm. Além disso, esses valores de H mais baixos são obtidos em uma velocidade linear mais alta e em um intervalo mais amplo de velocidades. Isso significa que a transferência de massa é aprimorada drasticamente com a partícula menor, permitindo melhor eficiência e resolução. Isso também significa que é possível utilizar um intervalo maior de velocidades lineares para obter esse desempenho aprimorado. As separações podem ser realizadas em velocidades lineares mais rápidas, melhorando, assim, a velocidade da análise, sem comprometer a resolução.

O impacto da expansão de faixa extracoluna (equipamento) em gráficos de van Deemter

Como a tecnologia UPLC ganhou impulso e popularidade no laboratório cromatográfico, os gráficos de van Deemter surgiram como um método popular para medir os ganhos de desempenho de partículas inferiores a 2 µm em relação aos tamanhos de partícula de HPLC existentes. Conclusões errôneas podem ser feitas se essas medições comparativas não forem realizadas em equipamentos que minimizem a contribuição da expansão de faixa extracoluna.

Para demonstrar a importância da expansão de faixa extracoluna na medição de desempenho, gráficos de van Deemter foram gerados em um equipamento de HPLC convencional (expansão de faixa = 7,2 µL), comparando partículas de 1,7 µm em relação a 2,5 µm (Figura 33). O substrato de partículas e o recheio da fase ligada das duas colunas eram idênticos. À primeira vista, os gráficos de van Deemter pressupõem que não há diferença significativa no desempenho dessas duas colunas. Como assim?

Nesse caso, a expansão de faixa do equipamento de HPLC resulta em uma medição de desempenho semelhante da coluna de UPLC de partículas de 1,7 µm em relação à coluna de HPLC de 2,5 µm. As larguras de pico menores produzidas por colunas de UPLC de partículas de 1,7 µm são afetadas mais significativamente pelo alargamento de faixa extracoluna do que colunas preenchidas com partículas maiores (por exemplo, 2,5 µm), produzindo, portanto, esse resultado enganoso.

O mesmo experimento foi conduzido em um Equipamento ACQUITY UPLC (largura de faixa = 2,8 µL). O Equipamento ACQUITY UPLC tem um volume de sistema aproximadamente 84% menor e uma expansão de faixa 60% menor do que o equipamento de HPLC.

Como pode ser visto na Figura 34, uma diferença perceptível é observada no desempenho dessas duas colunas quando operadas no Equipamento ACQUITY UPLC. Além das diferenças observadas no HETP, a velocidade linear ideal aumenta de 3,0 mm/s (partícula de 2,5 µm) para 10,0 mm/s (partícula de 1,7 µm), demonstrando os ganhos de desempenho de menor HETP (maior eficiência) e velocidade linear mais rápida (e, portanto, o rendimento) associado à tecnologia UPLC.

Manutenção da integridade da separação sem concessões

Agora que um entendimento básico das funções de expansão de faixa extracoluna e intracoluna foi estabelecido, podemos relacionar a medida desses termos (HETP em relação à velocidade linear) de uma maneira que seja mais prática: contagem de placas em relação à taxa de fluxo.

Conforme discutido anteriormente, a velocidade linear é a velocidade da fase móvel conforme ela flui através da coluna. É um termo utilizado para normalizar a taxa de fluxo da fase móvel independentemente do diâmetro interno da coluna, de forma que o desempenho de colunas com diferentes dimensões possa ser medido e comparado. A velocidade linear ideal está diretamente relacionada à taxa de fluxo ideal (Figura 35). As colunas de HPLC convencionais só podem ser operadas em um intervalo estreito de taxa de fluxo para atingir o desempenho ideal. Se uma operar fora desse intervalo, pode-se esperar uma diminuição no desempenho.

Uma abordagem comum para reduzir o tempo de análise (melhorar o rendimento) em HPLC convencional é simplesmente aumentar a taxa de fluxo. Com partículas maiores, o aumento da taxa de fluxo geralmente resulta em uma perda substancial na eficiência e, portanto, na resolução, já que agora você está operando acima da velocidade linear ideal para a partícula de HPLC (cromatografia comprimida). Essa é uma concessão significativa entre o desempenho cromatográfico e a velocidade de análise que está associada à HPLC (Figura 36).

A tecnologia UPLC não está sujeita a essas concessões. O tempo de análise pode ser reduzido sem sacrificar o desempenho. Quando o tamanho da partícula é reduzido de 3,5 µm para 1,7 µm, um aumento significativo na eficiência é observado (Figura 37). Isso ocorre devido às faixas cromatográficas estreitas que são produzidas pelas colunas de UPLC de partículas de 1,7 µm como resultado de uma expansão insignificante de faixa intracoluna. Além disso, essa eficiência adicional ocorre em uma taxa de fluxo mais alta (Figura 37). Isso significa que, para o mesmo comprimento de coluna, um aumento considerável na eficiência e, portanto, na resolução, pode ser alcançado em um tempo de análise mais curto.

Noções básicas do poder de resolução da coluna (L/dp)

Ao realizar uma separação cromatográfica, o objetivo principal é separar um componente de outro para que alguns ou todos os componentes possam ser medidos. O poder de resolução máximo de uma coluna pode ser estimado pela divisão do comprimento da coluna (L) pelo tamanho da partícula (d_p). A relação L/d_p é particularmente útil ao tentar determinar qual material de retenção de tamanho de partícula e o comprimento da coluna podem ser necessários para uma determinada aplicação (Figura 38).

Essa relação também pode ser utilizada como uma ferramenta para transferir métodos de um tamanho de partícula para outro. Uma coluna que tem uma relação de L/d_p de 30000 (separação moderadamente desafiadora) é uma seleção muito comum. Como pode ser visto na Figura 39, uma coluna de HPLC típica que produz um poder de resolução de 30000 tem 150 mm de comprimento e é preenchida com partículas de 5 µm. À medida que o tamanho da partícula diminui, o mesmo poder de resolução pode ser obtido em uma coluna mais curta (o que significa um tempo de análise menor; ou seja, uma coluna de 50 mm de comprimento preenchida com partículas de 1,7 µm atinge uma relação de L/d_p de 30000). Além de diminuir o comprimento da coluna, a taxa de fluxo ideal aumenta à medida que o tamanho da partícula diminui, o que aumenta ainda mais a redução no tempo de análise.

Isso é demonstrado cromatograficamente com mais clareza (Figura 40). Uma coluna de UPLC de 50 mm preenchida com partículas de 1,7 µm produz o mesmo poder de resolução que uma coluna de HPLC de 150 mm preenchida com partículas de 5 µm. Mantendo a relação L/d_p constante, o tempo de análise é reduzido em 10X, enquanto a resolução é mantida. As taxas de fluxo foram ajustadas na proporção inversa para cada tamanho de partícula. Os volumes de injeção foram escalados em proporção ao volume da coluna, de forma que a mesma carga de massa na coluna foi injetada.

Compreender a função da relação entre o comprimento da coluna e o tamanho da partícula (L/d_p) é a chave para o entendimento da tecnologia UPLC. A tecnologia UPLC é baseada no preenchimento eficiente de partículas pequenas e tolerantes à pressão em colunas curtas (alto rendimento) ou longas (alta resolução). Essas colunas de UPLC são utilizadas em um equipamento de LC projetado para operar na velocidade linear ideal (e pressão resultante) para essas partículas com mínima expansão de faixa.

Medição do desempenho de separação de gradiente (capacidade de pico)

Sob condições isocráticas, a contagem de placas (N) é uma medição das contribuições cumulativas de expansão de faixa do equipamento e da coluna. Devido ao alargamento de faixa relacionado à difusão, a largura de uma faixa de analito aumenta quanto mais tempo a faixa de analito é retida na fase estacionária.

Em uma corrida de gradiente, a força de eluição da fase móvel muda ao longo da análise. Isso faz com que faixas de analito retidas mais fortes se movam mais rapidamente através da coluna (alterando, assim, o tempo de retenção), mantendo as faixas mais concentradas (estreitas). Na cromatografia de fase reversa, o aumento da força de eluição da fase móvel controla a largura das faixas que estão sendo produzidas, resultando em larguras de pico semelhantes conforme as faixas passam através do detector. Como a largura do pico e o tempo de retenção estão sendo alterados pela alteração da força da fase móvel, a contagem de placas (devido à sua relação com a largura do pico) não é uma medição válida para separações de gradiente.

O poder de resolução (separação) de um gradiente pode ser calculado por sua capacidade de pico (P_c). Assim, a capacidade de pico é simplesmente o número teórico de picos que podem ser separados em um determinado tempo de gradiente. A capacidade do pico é inversamente proporcional à largura do pico. Portanto, para que o P_c aumente, a largura do pico deve diminuir.

A capacidade de pico pode ser aumentada drasticamente utilizando a tecnologia UPLC. O alto poder de resolução da tecnologia UPLC permite que mais informações por unidade de tempo sejam geradas aproveitando o poder de partículas inferiores a 2 µm em equipamentos de dispersão excepcionalmente baixa (largura de faixa de 2,8 µL). Isso facilita que mais informações possam ser coletadas a partir de uma determinada amostra. Por exemplo, um digesto tríptico de fosforilase b produz aproximadamente 70 picos identificados utilizando uma coluna de HPLC preenchida com partículas de 5 µm (Figura 43A). Com a tecnologia UPLC, o número de picos identificáveis aumenta de 70 para 168, melhorando, assim, a confiança na identificação de proteínas (Figura 43B).