Guia para iniciantes em UPLC

Na seção anterior, confirmamos o benefício de partículas cromatográficas menores e menor expansão de faixa do sistema (tanto o equipamento quanto a coluna). A tecnologia UPLC facilita um melhor desempenho cromatográfico minimizando a expansão de faixa do sistema para produzir separações mais eficientes em menos tempo, obtendo, assim, melhor qualidade dos dados. No entanto, a expansão de faixa não é o único fator que determina o desempenho que se pode obter com partículas pequenas. A pressão disponível do equipamento também desempenha um grande papel.

A pressão é gerada inerentemente quando a fase móvel passa através da tubulação de conexão da bomba até o injetor, do injetor até a coluna, da própria coluna, da tubulação da pós-coluna, bem como da célula do detector. A medição da pressão do sistema é um efeito cumulativo de todos esses componentes (equipamento e coluna). À medida que a taxa de fluxo aumenta, a pressão produzida pela fase móvel que flui através da própria tubulação de conexão aumentará. Além disso, o diâmetro interno da tubulação, bem como seu comprimento, também afetará a quantidade de pressão que será gerada em combinação com a taxa de fluxo. A diferença de pressão entre duas colunas pode ser comparada com as previsões teóricas se a pressão gerada pelo próprio equipamento for subtraída da pressão total do sistema (equipamento + coluna).

Conforme o tamanho da partícula é reduzido, a contrapressão aumenta a uma taxa que é inversamente proporcional ao quadrado do diâmetro da partícula. Simultaneamente, a velocidade ideal da fase móvel (velocidade linear) aumenta com a diminuição do diâmetro da partícula. Portanto, a pressão na velocidade linear ideal para um determinado tamanho de partícula aumenta a uma taxa que é inversamente proporcional ao cubo do diâmetro da partícula (Figura 44).

Essa é uma limitação significativa ao tentar utilizar colunas de partículas menores em equipamentos de HPLC convencionais para melhorar a resolução cromatográfica (mantendo o comprimento da coluna constante enquanto reduz o tamanho das partículas) ou para melhorar a velocidade da análise enquanto preserva a resolução (mantendo a relação L/d_p constante). Devido às limitações de pressão dos equipamentos de HPLC convencionais

(350–400 bar; 5000–6000 psi), a utilização de partículas menores geralmente resulta em uma restrição do comprimento da coluna ou operação em velocidades lineares (taxas de fluxo) abaixo do ideal.

Para um comprimento de coluna constante, a teoria prevê que, se o tamanho da partícula diminuir de 5,0 µm para 1,7 µm (diminuição de 3X no tamanho da partícula), estima-se que a contrapressão aumente 27X. Aproximando-se das previsões teóricas, a pressão do sistema aumentou 22X ao fazer a transição de uma coluna de 5,0 µm para uma coluna de 1,7 µm do mesmo comprimento. Como observado, a coluna de 1,7 µm está operando bem acima do limite de pressão superior de um equipamento de HPLC convencional (Figura 45).

O grande aumento na contrapressão observado pela diminuição do tamanho das partículas é um dos principais motivos pelos quais as colunas de partículas inferiores a 2 µm (e os equipamentos de LC correspondentes) nunca foram comercialmente bem-sucedidos até o advento do Sistema ACQUITY UPLC.

Se a meta de separação for manter a resolução enquanto reduz o tempo de análise (mantendo a relação L/d_p constante), o aumento na pressão será muito menor do que manter constante o comprimento da coluna enquanto reduz o tamanho da partícula. A mudança na pressão é inversamente proporcional ao quadrado do tamanho da partícula (em vez do tamanho da partícula ao cubo) devido à redução proporcional no comprimento da coluna.

Neste exemplo, o comprimento da coluna e o tamanho da partícula são reduzidos em 3X (Figura 47). Isso significa que a contrapressão deve aumentar 9X. Os valores observados coincidem estreitamente com as previsões teóricas. Mantendo a relação L/d_p constante, um aumento de 11X na contrapressão é observado ao fazer a transição de uma coluna de 5,0 µm e 150 mm para uma coluna de 1,7 µm e 50 mm de comprimento.

Quando executada em sua taxa de fluxo ideal, a pressão produzida por partículas menores excederá as limitações de pressão dos sistemas HPLC convencionais. O Sistema ACQUITY UPLC (limite de pressão superior de 1030 bar, 15000 psi) foi projetado para acomodar essas pressões, permitindo que partículas inferiores a 2 µm sejam executadas com êxito em sua taxa de fluxo ideal.

Temperatura elevada

Uma abordagem para compensar as pressões mais altas produzidas por partículas pequenas é elevar a temperatura da coluna. À medida que a temperatura da coluna aumenta, a viscosidade da fase móvel diminui, resultando em uma contrapressão mais baixa (se a taxa de fluxo for mantida constante). No entanto, a velocidade com que as moléculas do analito entram e saem dos poros da fase estacionária (difusão) também aumenta, resultando na necessidade de aumentar a taxa de fluxo para manter o desempenho.

Ao aumentar a temperatura da coluna de 30 °C para 90 °C, a taxa de fluxo deve ser aumentada para manter a eficiência (Figura 48). Nenhum ganho de eficiência é observado ao comparar a maior contagem de placas em qualquer temperatura, o que está de acordo com a teoria cromatográfica.

Uma comparação mais interessante pode ser feita se a contagem de placas for representada em gráfico em relação à pressão do sistema (Figura 49). Representando graficamente os dados desta forma, pode-se ver claramente que a eficiência máxima da coluna é atingida aproximadamente à mesma pressão do sistema, independentemente da temperatura da separação. Isso significa que a temperatura elevada não pode ser utilizada para contornar as pressões associadas à utilização de pequenas partículas. Em outras palavras, um equipamento de HPLC convencional não é adequado para a utilização eficiente de partículas muito pequenas.