Guia para iniciantes em UPLC

Ao entender os princípios cromatográficos descritos neste primer e como eles são aplicados, torna-se aparente que mais do que apenas pequenas partículas e pressão mais alta devem ser considerados para maximizar o desempenho das separações. Para obter o benefício cromatográfico das colunas de partículas inferiores a 2 µm, é necessário executar essas colunas em um equipamento projetado especificamente para acomodar as pressões produzidas por partículas menores, bem como para minimizar a expansão de faixa. Não é possível obter isso com sistemas HPLC convencionais.

O Sistema ACQUITY UltraPerformance LC é uma solução projetada holisticamente que melhora o desempenho e a qualidade dos dados analíticos de separações cromatográficas considerando todos os aspectos do design do equipamento e da coluna.

Agora deve estar claro que a chave para as separações por UPLC é a combinação do desempenho do equipamento e da coluna que permite que os cientistas obtenham e aproveitem totalmente o poder das colunas de partículas inferiores a 2 µm. Isso é obtido por meio da minimização da expansão de faixa dentro (intracoluna) e fora (extracoluna) da coluna e pela capacidade de operar nas velocidades lineares (e pressões) ideais dessas colunas de partículas pequenas (Figura 51).

Maximização do poder de separação

Para maximizar o poder de separação, é possível combinar a utilização de pequenas partículas com temperatura e pressão elevadas para desenvolver separações de eficiência ultra-alta utilizando a tecnologia UPLC.

A Figura 52A é uma única coluna de UPLC de 1,7 µm com 150 mm de comprimento produzindo pouco menos de 40000 placas a 90 °C. Uma segunda coluna foi adicionada em série para produzir um comprimento de 300 mm, resultando em uma contagem de placas de 83000 (Figura 52B). O intervalo total de pressão do Sistema ACQUITY UPLC é explorado pela adição de uma terceira coluna em série, resultando em uma coluna de UPLC de 450 mm preenchida com partículas de 1,7 µm. Conforme observado na Figura 52C, uma eficiência de 121000 placas é alcançada em apenas 8 minutos.

O poder de separação do gradiente também pode ser aumentado utilizando a mesma lógica. Neste exemplo, duas colunas de UPLC de 1,7 µm com 150 mm de comprimento (comprimento total de 300 mm) foram ligadas em série para melhorar drasticamente as informações obtidas para a identificação de metabólitos (Figura 53). Uma capacidade de pico de mais de 1000 foi alcançado em um tempo de corrida de uma hora. A capacidade de caracterizar completamente essa amostra de urina permite a identificação de metabólitos de candidatos a produtos farmacêuticos, a detecção e identificação de marcadores de toxicidade e a detecção de toxinas no monitoramento de medicamentos terapêuticos. Nesse caso, o poder de resolução e, portanto, a qualidade do espectro de massas são drasticamente melhorados, resultando em uma análise de dados simplificada, limites de detecção aprimorados e maior confiança no ensaio.

Um único sistema para separações por HPLC e UPLC

O Sistema ACQUITY UPLC foi projetado para lidar com os crescentes desafios organizacionais para fornecer produtos ao mercado mais rapidamente enquanto mantém ou melhora a qualidade das informações. Desde 2004, inúmeras organizações adotaram a tecnologia UPLC como plataforma analítica de rotina, substituindo a HPLC convencional.

Ao adotar uma nova tecnologia, é importante considerar suas capacidades para atender à demanda existente e futura. Com a tecnologia UPLC, é possível investir no futuro utilizando um único sistema com a capacidade de executar de forma ideal colunas inferiores a 2 µm e a solidez e robustez para executar métodos de HPLC legados. Isso significa que uma única plataforma de tecnologia pode ser utilizada independentemente das necessidades de separações, facilitando, assim, uma maior produtividade simplificando a transferência de métodos de um local para outro.

A Figura 54 mostra um exemplo da capacidade de executar o Sistema ACQUITY UPLC como um HPLC padrão. Este é o método USP para Excedrin (analgésico de venda livre) executado em um sistema HPLC convencional (Figura 54A) e em um Sistema ACQUITY UPLC (Figura 54B). O método cromatográfico, as fases móveis, a amostra e a coluna foram simplesmente movidos de um equipamento para o outro. Como resultado do design ideal do sistema, maior eficiência e sensibilidade são observadas para o mesmo ensaio no Sistema ACQUITY UPLC sem alterações na seletividade ou retenção relativa.

Conclusão

Este primer de tecnologia foi projetado para fornecer ao leitor uma compreensão básica dos princípios cromatográficos que embasam a tecnologia UPLC. Esperamos que o leitor agora compreenda as melhorias significativas na resolução, sensibilidade e velocidade que podem ser alcançadas para separações cromatográficas minimizando as contribuições de expansão de faixa do equipamento e da coluna. Além da expansão de faixa mínima, esse sistema precisa ser capaz de operar na velocidade linear (e pressão) ideal para colunas de partículas pequenas (inferiores a 2 µm). O Sistema ACQUITY UPLC foi projetado para atender às necessidades presentes e futuras dos cientistas de separação.

Os ganhos teóricos de eficiência e resolução descritos neste primer já tinham sido previstos décadas atrás. Pela primeira vez, a teoria foi colocada em prática em uma escala disponível comercialmente com a introdução do Sistema ACQUITY UPLC em 2004. Desde então, muitos milhares de cientistas de separações em todo o mundo adotaram a tecnologia UPLC e os benefícios práticos que ela pode proporcionar às suas organizações. O Sistema ACQUITY UPLC permite que as organizações gerenciem os ativos da empresa com mais eficiência melhorando a qualidade das informações cromatográficas e reduzindo o tempo necessário para adquirir essas informações. Isso impulsiona a produtividade organizacional, pois supera muitos dos desafios e gargalos presentes no laboratório de separações analíticas. Além de proporcionar uma economia óbvia e significativa de custos de consumíveis, separações mais curtas e confiáveis também beneficiam o ambiente ao exigir quantidades significativamente menores de solventes orgânicos. 

Curiosamente, a maioria dos principais fabricantes de equipamentos, que originalmente minimizaram a importância de um sistema cromatográfico com maior capacidade de pressão (citando preocupações com segurança, robustez, compatibilidade de amostras, etc.), já comprovou a necessidade de tal plataforma de LC desenvolvendo vários sistemas próprios com maior capacidade de pressão. Embora esses sistemas venham com algumas concessões (por exemplo, limites de pressão mais baixos, grande expansão de faixa, escolhas de detecção limitadas, etc.),essa tendência incontestável em direção a um desempenho cromatográfico superior indica que a ciência de separações ainda está avançando.

Referências para leituras adicionais:

1. U.D. Neue, “HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice,” Wiley-VCH [1997]
2. J.C. Aresenault and P.D. McDonald, “Beginners Guide to Liquid Chromatography,” Waters [2009]
3. P.D. McDonald, “The Quest for Ultra Performance in Liquid Chromatography: Origins of UPLC Technology,” Waters [2009]
4. M.P. Balogh, “The Mass Spectrometry Primer,” Waters [2009]