Guia para iniciantes em UPLC

Uma mistura de amostras é transferida de um vial de amostra para um fluxo de fluidos em movimento (fase móvel). A amostra é então transportada pela fase móvel para o cabeçote de uma coluna cromatográfica por uma bomba de alta pressão. A fase móvel e a mistura de amostras injetada entram na coluna, passam pelo leito de partículas e saem, transferindo a mistura separada para um detector (Figura 3).

Primeiro, vamos considerar como a faixa de amostra é separada em faixas de analito individuais (a direção do fluxo é representada por setas verdes). A Figura 4A representa a coluna no tempo zero (momento da injeção), quando a amostra entra na coluna e começa a formar uma faixa. A amostra mostrada aqui, uma mistura de corantes amarelos, vermelhos e azuis, aparece na entrada da coluna como uma única faixa preta.

Após alguns minutos, durante os quais a fase móvel flui de forma contínua e constante através das partículas do material de retenção, podemos ver que os corantes individuais se moveram em faixas separadas em velocidades diferentes (Figura 4B). Isso ocorre porque há uma competição entre a fase móvel e a fase estacionária para atrair cada um dos corantes ou analitos. Observe que a faixa do corante amarelo se move mais rápido e está prestes a sair da coluna. O corante amarelo tem uma afinidade maior com (é atraído pela) a fase móvel mais do que os outros corantes. Portanto, ele se move a uma velocidade mais rápida, mais próxima à da fase móvel. A faixa de corante azul tem maior afinidade com o material de retenção do que a fase móvel. Sua atração mais forte pelas partículas faz com que ele se mova significativamente mais lento. Em outras palavras, é o composto mais retido nesta mistura de amostras. A faixa de corante vermelho tem uma atração intermediária pela fase móvel e, portanto, move-se a uma velocidade intermediária através da coluna. Como cada faixa de corante se move a uma velocidade diferente, podemos separar a mistura cromatograficamente.

Como uma faixa cromatográfica se torna um pico

Cada faixa de analito específica é composta por muitas moléculas de analito. O centro da faixa contém a maior concentração de moléculas de analito; enquanto as bordas anteriores e de trás da faixa são cada vez menos concentradas à medida que interagem com a fase móvel (Figura 5).

À medida que as faixas de corante separadas deixam a coluna, elas passam imediatamente para um detector. O detector vê (detecta) cada faixa de composto separada contra um background de fase móvel (veja a Figura 6). Um detector apropriado (UV, ELS, fluorescência, massa, etc.)tem a capacidade de detectar a presença de um composto e enviar seu sinal elétrico correspondente para uma estação de dados de computador, onde é registrado como um pico. O detector responde à concentração variável das moléculas de analito específicas dentro da faixa, em que o centro da faixa (maior população de moléculas de analito) é interpretado pelo detector como o ápice do pico.

O que é um cromatograma?

Um cromatograma é uma representação da separação que ocorreu quimicamente (cromatograficamente) no sistema HPLC. Uma série de picos subindo de uma linha de base é desenhada em um eixo de tempo. Cada pico representa a resposta do detector para um composto diferente. O cromatograma é representado em gráfico pela estação de dados do computador (veja a Figura 6). A faixa amarela passou completamente através da célula de fluxo do detector; o sinal elétrico gerado foi enviado para a estação de dados do computador. O cromatograma resultante começou a aparecer na tela. Observe que o cromatograma começa quando a amostra é injetada pela primeira vez e inicia como uma linha reta definida perto da parte inferior da tela. Isso é chamado de linha de base; representa a fase móvel pura que passa através da célula de fluxo ao longo do tempo. Conforme a faixa amarela do analito passa através da célula de fluxo, um sinal (que varia dependendo da concentração das moléculas do analito) é enviado ao computador. A linha se curva, primeiro para cima e depois para baixo, em proporção à concentração do corante amarelo na faixa da amostra. Isso cria um pico no cromatograma. Depois que a faixa amarela passa completamente para fora da célula do detector, o nível do sinal retorna à linha de base; a célula de fluxo agora tem, mais uma vez, apenas fase móvel pura. Como a faixa amarela se move mais rápido, eluindo primeiro a partir da coluna, é o primeiro pico traçado. Um pouco mais tarde, a faixa vermelha atinge a célula de fluxo. O sinal sobe a partir da linha de base quando a faixa vermelha entra pela primeira vez na célula, e o pico que representa a faixa vermelha começa a ser traçado. Neste diagrama, a faixa vermelha não passou totalmente pela célula de fluxo. O diagrama mostra como a faixa vermelha e o pico vermelho ficariam se interrompêssemos o processo neste momento. Como a maior parte da faixa vermelha passou pela célula, a maior parte do pico foi traçada, conforme mostrado pela linha contínua. Se continuarmos o processo cromatográfico, a faixa vermelha passará completamente através da célula de fluxo, e o pico vermelho será concluído (linha pontilhada). A faixa azul, a mais fortemente retida, se desloca na taxa mais lenta e elui após a faixa vermelha. A linha pontilhada mostra como o cromatograma completo apareceria se tivéssemos deixado a corrida continuar até sua conclusão. É interessante notar que a largura do pico azul será a mais larga devido à largura da faixa de analito azul, embora seja mais estreita na coluna, tornando-se a mais larga quando sai da coluna. Isso ocorre porque ele se move mais lentamente através do leito do material de retenção cromatográfico e requer mais tempo (e volume de fase móvel) para ser eluído completamente. Como a fase móvel flui continuamente a uma taxa fixa, isso significa que a faixa azul se alarga e é mais diluída. O detector responde em proporção à concentração da faixa; portanto, o pico azul é menor em altura e maior em largura.

Expansão de faixa

Antes que a faixa da amostra/analito atinja o detector, ela passará por vários componentes do sistema cromatográfico que contribuirão para a distorção e o alargamento da faixa cromatográfica (Figura 7). Esse fenômeno é conhecido como expansão de faixa. À medida que a faixa de analito fica mais larga, a largura do pico cromatográfico resultante é aumentada. A faixa mais larga resulta em um efeito de diluição que produz uma diminuição na altura do pico acompanhada por uma perda na sensibilidade e resolução. Por outro lado, se a expansão de faixa for minimizada, faixas cromatográficas mais estreitas serão obtidas, resultando em maior eficiência. Esses picos cromatográficos mais altos e estreitos são mais fáceis de serem vistos pelo detector, permitindo maior sensibilidade e resolução devido a uma faixa de analito mais concentrada. Portanto, é importante estar ciente dos fatores que influenciam a expansão de faixa nos esforços para reduzir e controlar essas influências para melhorar o desempenho cromatográfico geral.

Dentro de um sistema cromatográfico, as influências de coluna e extracoluna (tudo que está fora da coluna) contribuem para a expansão de faixa. As fontes causadas pela extracoluna incluem o volume de injeção, o caminho de fluidos do equipamento entre o injetor de amostra e a coluna, e da saída da coluna até o detector (incluindo a célula de fluxo) e todas as conexões nele incluídas. As fontes de expansão de faixa causadas pela coluna incluem o tamanho da partícula do material de retenção, a qualidade do preenchimento do material dentro da coluna e suas características de difusão em relação à velocidade da fase móvel, à geometria e ao tamanho do analito. A soma das variâncias (σ2) para cada um desses colaboradores afeta a largura de um pico (Figura 8).

Para obter um desempenho significativamente melhorado em cromatografia líquida, é necessária uma redução nas influências de expansão de faixa extracoluna e da coluna. O Sistema ACQUITY UPLC é baseado no conceito de redução de ambas as formas de expansão de faixa, de forma que melhorias proveitosas na eficiência e na sensibilidade possam ser alcançadas (Figura 9).

Abordagem da expansão de faixa extracoluna (equipamento)

Para realizar uma melhoria significativa no desempenho cromatográfico, um trabalho de engenharia significativo foi realizado para projetar um equipamento de LC que pudesse acomodar as pressões produzidas por preenchimentos de partículas pequenas (inferiores a 2 µm) e, ao mesmo tempo, pudesse minimizar a dispersão do caminho do fluxo de tal forma que o desempenho teórico da coluna de separação pudesse ser alcançado. Da mesma forma, é importante que o equipamento seja uma ferramenta analítica confiável, robusta e precisa para utilização de rotina em laboratório. Para demonstrar a importância do design do equipamento, é necessário entender como a dispersão do sistema (equipamento + expansão de faixa da coluna) pode afetar os resultados cromatográficos.

A medição da contagem de placas (N), ou eficiência, leva em consideração a dispersão de um pico. A largura de um pico está diretamente relacionada à largura da faixa de analito conforme ele passa pelo detector, enquanto o ápice desse pico é o ponto no qual a maior concentração de moléculas do analito existe dentro dessa faixa. Essa medição é realizada sob condições isocráticas.

A equação da contagem de placas pode ser derivada como mostrado na Figura 10, em que (Vn) é o volume de eluição do pico, (w) é a largura do pico e (a) é uma constante que é determinada com base na altura do pico em que a largura do pico é medida. Cada método de medição da largura do pico produzirá resultados de contagem de placa idênticos, desde que o pico seja perfeitamente simétrico. Se o pico exibir qualquer avanço ou cauda, esses métodos de medição produzirão resultados diferentes.

É um equívoco comum considerar que a contagem de placas se refira apenas ao desempenho alcançado pela própria coluna. No entanto, a expansão de faixa da coluna e do equipamento também influencia a largura do pico a partir da qual a contagem de placas é determinada. Para demonstrar a influência do próprio equipamento na expansão de faixa, uma única coluna de HPLC foi executada em dois equipamentos diferentes; um HPLC padrão (expansão de faixa = 7,2 µL) e um Sistema ACQUITY UPLC (expansão de faixa = 2,8 µL). Como a mesma coluna é executada em ambos os sistemas, a contribuição de expansão de faixa da coluna é mantida constante. O aumento na eficiência observado no Sistema ACQUITY UPLC demonstra como um equipamento com menos expansão de faixa gerará larguras de pico mais estreitas, resultando em uma contagem de placas mais alta (Figura 11).

A influência do comprimento e do diâmetro da tubulação

Depois que a faixa de amostra é introduzida no fluxo de fluidos, ela se desloca para a coluna. O Gerenciador de amostras ACQUITY UPLC foi projetado para minimizar a distância entre o injetor e a entrada da coluna, a fim de minimizar a expansão de faixa. A coluna separa a faixa de amostra em faixas de analito individuais. Em seguida, as faixas de analitos separadas cromatograficamente são transferidas da coluna para o detector. À primeira vista, pode-se não considerar a importância do diâmetro interno (DI) da tubulação que conecta a saída da coluna e a entrada do detector. No entanto, o diâmetro interno pode afetar muito a expansão de faixa do equipamento (Figura 12).

Como é de se esperar, a expansão de faixa diminuirá com a diminuição do DI da tubulação. Fluindo uma faixa de analito concentrada em um tubo de DI grande, a faixa ficará muito menos concentrada, resultando em um pico mais amplo e distorcido e menor sensibilidade. Além disso, o atrito ao longo das paredes da tubulação fará com que as moléculas do analito em contato com as paredes da tubulação se movam mais lentamente do que as moléculas no centro do tubo, resultando em um perfil de faixa distorcido. A distância entre o centro e as bordas externas da faixa de analito fica menor à medida que o DI da tubulação diminui. Isso reduz a quantidade de distorção na faixa. Da mesma forma, é importante minimizar o comprimento da tubulação, pois comprimentos excessivos também podem distorcer uma faixa de amostra.

O impacto das configurações do detector na expansão de faixa extracoluna

Além das contribuições de expansão de faixa baseadas em fluidos do equipamento, as configurações do detector digital relacionadas à velocidade de aquisição e à constante de filtro também influenciam o resultado cromatográfico. Isso é especialmente importante para aplicações de UPLC, uma vez que as larguras de pico são frequentemente muito estreitas (1 ou 2 segundos de largura) e o tempo de análise pode ser muito curto. Ao definir a velocidade de aquisição do detector, a seleção deve ser baseada na aquisição de pontos de dados suficientes ao longo de um pico para representar adequadamente o pico. Definir a taxa do detector muito alta terá um impacto negativo na relação sinal-ruído, fazendo com que o ruído da linha de base aumente sem um aumento na altura do sinal do analito de interesse. Por outro lado, definir a taxa de aquisição do detector muito lenta resultará em pontos de dados inadequados no pico, reduzindo, assim, a eficiência cromatográfica observada e comprometendo a capacidade de realizar a quantificação de forma reprodutível. Além disso, uma constante de tempo (filtro digital) é utilizada para suavizar os pontos de dados para otimizar a relação sinal-ruído e pode ser utilizada em conjunto com a velocidade de aquisição ou independentemente dela.

As configurações do detector ficam cada vez mais importantes à medida que a largura da faixa de analito diminui. Isso requer uma velocidade de aquisição que não seja apenas rápida o suficiente para criar digitalmente um pico dessa velocidade, mas também para processar de maneira adequada a separação de alta resolução alcançada na coluna de UPLC, se houver picos de eluição próximos.

Em taxas de fluxo mais lentas, quando os picos são mais dispersos no tempo, essas configurações são mais tolerantes. No entanto, conforme os picos ficam mais estreitos e a análise mais rápida (como nas separações por UPLC), uma configuração criteriosa de velocidade de aquisição e constante de tempo deve ser mantida (Figura 13). Ao utilizar a tecnologia UPLC para aplicações "reais", é aconselhável selecionar a taxa de aquisição de dados do detector (Hz) que captura com precisão o formato do pico mais estreito e, em seguida, aplicar uma constante do tempo de filtragem (segundos) que forneça uma relação sinal-ruído e resolução ideais para a análise.