Guia para iniciantes em cromatografia líquida

Em geral, três características principais de compostos químicos podem ser utilizadas para criar separações por HPLC. São elas:

• Polaridade
• Carga elétrica
• Tamanho molecular

Primeiro, vamos considerar a polaridade e os dois modos de separação principais que exploram essa característica: cromatografia de fase normal e de fase reversa.

Separações baseadas na polaridade

A estrutura, a atividade e as características físico-químicas de uma molécula são determinadas pelo arranjo de seus átomos constituintes e pelas ligações entre eles. Dentro de uma molécula, um arranjo específico de determinados átomos que é responsável por propriedades especiais e reações químicas previsíveis é chamado de grupo funcional. Essa estrutura geralmente determina se a molécula é polar ou não polar. As moléculas orgânicas são classificadas em classes de acordo com o(s) principal(is) grupo(s) funcional(is) que cada uma contém. Utilizando um modo de separação baseado na polaridade, a retenção cromatográfica relativa de diferentes tipos de moléculas é amplamente determinada pela natureza e localização desses grupos funcionais. Como mostrado na Figura P, as classes de moléculas podem ser ordenadas por sua retenção relativa em um intervalo ou espectro de polaridade cromatográfica de altamente polar a altamente não polar.

A água (uma pequena molécula com um alto momento de dipolo) é um composto polar. O benzeno (um hidrocarboneto aromático) é um composto não polar. Moléculas com polaridade cromatográfica semelhante tendem a ser atraídas entre si; aquelas com polaridade diferente exibem uma atração muito mais fraca, se houver, e podem até repelir uma a outra. Isso se torna a base para os modos de separação cromatográfica baseados na polaridade.

Outra maneira de pensar nisso é pela analogia familiar: óleo (não polar) e água (polar) não se misturam. Ao contrário do magnetismo, em que os polos opostos se atraem, as separações cromatográficas baseadas na polaridade dependem da atração mais forte entre semelhantes e da atração mais fraca entre os opostos. Lembre-se de que “Semelhante atrai semelhante” na cromatografia baseada em polaridade.

Para projetar um sistema de separação cromatográfica (veja a Figura Q), criamos uma competição para os vários compostos contidos na amostra escolhendo uma fase móvel e uma fase estacionária com polaridades diferentes. Em seguida, os compostos na amostra que são semelhantes em polaridade à fase estacionária (material de retenção da coluna) serão atrasados porque são mais fortemente atraídos pelas partículas. Os compostos cuja polaridade é semelhante à da fase móvel serão preferencialmente atraídos por ela e se moverão mais rapidamente.

Dessa forma, com base nas diferenças na atração relativa de cada composto para cada fase, uma separação é criada alterando as velocidades dos analitos.

As figuras R-1, R-2 e R-3 exibem intervalos de polaridade cromatográfica típicos para fases móveis, fases estacionárias e analitos de amostra, respectivamente. Vamos considerar um de cada vez para ver como um cientista escolhe as fases apropriadas para desenvolver a competição de atração necessária para obter uma separação por HPLC baseada em polaridade.

Uma escala, como a mostrada na Figura R-1, na qual alguns solventes comuns são colocados em ordem de polaridade cromatográfica relativa, é chamada de série eluotrópica. As moléculas de fase móvel que competem efetivamente com as moléculas de analito pelos locais atrativos da fase estacionária deslocam esses analitos, fazendo com que se movam mais rapidamente através da coluna (retidos fracamente). A água está na extremidade polar da escala de solvente de fase móvel, enquanto o hexano, um hidrocarboneto alifático, está na extremidade não polar. No meio, solventes individuais, bem como misturas de solventes miscíveis (misturados em proporções apropriadas para atender aos requisitos de separação específicos), podem ser colocados em ordem de força de eluição. Qual extremidade da escala representa a fase móvel "mais forte" depende da natureza da superfície da fase estacionária onde ocorre a competição pelas moléculas do analito.

A sílica tem uma superfície hidrofílica ativa (que adora água) contendo grupos funcionais de silanol ácido (análogo do álcool contendo silício). Consequentemente, ela se encaixa na extremidade polar da escala de fase estacionária mostrada na Figura R-2. A atividade ou polaridade da superfície da sílica pode ser modificada seletivamente por meio da ligação química a ela de grupos funcionais menos polares (fase ligada). Os exemplos mostrados aqui incluem, em ordem decrescente de polaridade, as porções de cianopropilsilil-[CN], n-octilsilil-[C₈] e n-octadecilsilil- [C₁₈, ODS] na sílica. Este último é um preenchimento hidrofóbico (que odeia a água) muito apolar.

A Figura R-3 repete o espectro de polaridade cromatográfica de nossa amostra (mostrado na Figura P). Depois de considerar a polaridade de ambas as fases, então, para uma determinada fase estacionária, um cientista deve escolher uma fase móvel na qual os analitos de interesse são retidos, mas não tão fortemente que não possam ser eluídos. Entre os solventes de força semelhante, o cientista considera qual combinação de fases pode explorar melhor as diferenças mais sutis na polaridade e na solubilidade do analito para maximizar a seletividade do sistema cromatográfico. Semelhante atrai semelhante, mas, como você provavelmente pode imaginar a partir da discussão até agora, criar uma separação com base na polaridade envolve o conhecimento da amostra e a experiência com vários tipos de analitos e modos de retenção. Para resumir, o cientista escolherá a melhor combinação de fase móvel e fase estacionária de partículas com polaridades opostas adequadas. Então, conforme os analitos da amostra se movem através da coluna, a regra “semelhante atrai semelhante” determinará quais analitos ficam mais lentos e quais prosseguem em uma velocidade mais rápida.

HPLC de fase normal

Em suas separações de extratos de plantas, Tswett foi capaz de utilizar uma fase estacionária polar (giz em uma coluna de vidro; veja a Figura A) com uma fase móvel muito menos polar (não polar). Esse modo clássico de cromatografia ficou conhecido como fase normal.

A Figura S-1 representa uma separação cromatográfica de fase normal de nossa mistura de teste de três corantes. A fase estacionária é polar e retém com mais força o corante amarelo polar. O corante azul relativamente não polar é vencido na competição de retenção pela fase móvel, um solvente não polar, e elui rapidamente. Como o corante azul é mais parecido com a fase móvel (ambos são não polares), ele se move mais rápido. É característico para a cromatografia de fase normal em sílica que a fase móvel seja 100% orgânica; não é utilizado água.

HPLC de fase reversa

O termo fase reversa descreve o modo de cromatografia que é exatamente o oposto da fase normal, ou seja, a utilização de uma fase móvel polar e uma fase estacionária não polar (hidrofóbica). A Figura S-2 ilustra a mistura de três corantes pretos sendo separada utilizando esse protocolo.

Agora, o composto mais fortemente retido é o corante azul mais apolar, pois sua atração para a fase estacionária não polar é maior. O corante amarelo polar, sendo fracamente retido, é vencido em competição pela fase móvel aquosa polar, move-se mais rapidamente através do leito e elui o semelhante atrai semelhante mais cedo.

Atualmente, por ser mais reprodutível e ter ampla aplicabilidade, a cromatografia de fase reversa é utilizada para aproximadamente 75% de todos os métodos de HPLC. A maioria desses protocolos usa como fase móvel uma mistura aquosa de água com um solvente orgânico polar miscível, como acetonitrila ou metanol. Isso normalmente garante a interação adequada dos analitos com a superfície da partícula hidrofóbica e não polar. Uma sílica ligada C₁₈ (às vezes, chamada de ODS) é o tipo mais popular de preenchimento de HPLC de fase reversa.

A Tabela C apresenta um resumo das características de fase para os dois principais modos de separação por HPLC com base na polaridade. Lembre-se, para esses modos baseados em polaridade, semelhante atrai semelhante.

Cromatografia de interação hidrofílica (HILIC, Hydrophilic-Interaction Chromatography)

A HILIC pode ser vista como uma variante da cromatografia de fase normal. Na cromatografia de fase normal, a fase móvel é 100% orgânica. Apenas traços de água estão presentes na fase móvel e nos poros das partículas de preenchimento polar. Os analitos polares ligam-se fortemente à fase estacionária polar e podem não eluir.

Adicionar um pouco de água (<20%) à fase móvel orgânica (normalmente um solvente aprótico como a acetonitrila) possibilita separar e eluir compostos polares que são fortemente retidos no modo de fase normal (ou fracamente retidos no modo de fase reversa). A água, um solvente muito polar, compete efetivamente com os analitos polares pela fase estacionária. A HILIC pode ser executada nos modos de eluição isocrático ou de gradiente. Os compostos polares que são inicialmente atraídos pelas partículas do material de retenção polar podem ser eluídos conforme a polaridade (força) da fase móvel é aumentada (pela adição de mais água). Os analitos são eluídos em ordem crescente de hidrofilicidade (polaridade cromatográfica em relação à água). Tampões ou sais podem ser adicionados à fase móvel para manter os analitos ionizáveis em uma única forma.

Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC, Hydrophobic-Interaction Chromatography)

HIC é um tipo de cromatografia de fase reversa utilizada para separar biomoléculas grandes, como proteínas. Normalmente, é desejável manter essas moléculas intactas em uma solução aquosa, evitando o contato com solventes orgânicos ou superfícies que possam desnaturá-las. A HIC aproveita as vantagens da interação hidrofóbica de moléculas grandes com uma fase estacionária moderadamente hidrofóbica, por exemplo, sílica ligada por butila [C₄], em vez de sílica ligada por octadecila [C₁₈]. Inicialmente, concentrações mais altas de sal na água estimularão que as proteínas sejam retidas (sem sal) no preenchimento. As separações de gradiente normalmente são executadas por meio da redução da concentração de sal. Dessa forma, as biomoléculas são eluídas em ordem crescente de hidrofobicidade.

Separações baseadas em carga: cromatografia de troca iônica (IEC, Ion-Exchange Chromatography)

Para separações baseadas na polaridade, semelhante é atraído por semelhante, e os opostos podem ser repelidos. Na cromatografia de troca iônica e em outras separações baseadas em carga elétrica, a regra é invertida. Semelhantes podem repelir, enquanto opostos são atraídos um pelo outro. As fases estacionárias para separações de troca iônica são caracterizadas pela natureza e força das funções ácidas ou básicas em suas superfícies e pelos tipos de íons que atraem e retêm. A troca catiônica é utilizada para reter e separar íons carregados positivamente em uma superfície negativa. Por outro lado, a troca aniônica é utilizada para reter e separar íons carregados negativamente em uma superfície positiva (veja a Figura T). Com cada tipo de troca iônica, existem pelo menos duas abordagens gerais para separação e eluição.

Os trocadores de íons fortes carregam grupos funcionais (por exemplo, aminas quaternárias ou ácidos sulfônicos) que estão sempre ionizados. Eles são normalmente utilizados para reter e separar íons fracos. Esses íons fracos podem ser eluídos por deslocamento com uma fase móvel contendo íons que são mais fortemente atraídos pelos locais da fase estacionária. Como alternativa, os íons fracos podem ser retidos na coluna e depois neutralizados pela alteração in situ do pH da fase móvel, fazendo com que percam sua atração e eluam.

Trocadores de íons fracos (por exemplo, com funções de amina secundária ou ácido carboxílico) podem ser neutralizados acima ou abaixo de um determinado valor de pH e perder sua capacidade de reter íons por carga. Quando carregados, eles são utilizados para reter e separar íons fortes. Se esses íons não puderem ser eluídos por deslocamento, os locais de troca de fase estacionária podem ser neutralizados, desligando a atração iônica e permitindo a eluição dos analitos carregados.

Quando os trocadores de íons fracos são neutralizados, eles podem reter e separar espécies por interações hidrofóbicas (fase reversa) ou hidrofílicas (fase normal); nesses casos, a força de eluição é determinada pela polaridade da fase móvel (Figura R-1). Assim, trocadores de íons fracos podem ser utilizados para separações de modo misto (separações com base na polaridade e na carga).

A Tabela D descreve as diretrizes para as principais categorias de troca iônica. Por exemplo, para reter um analito fortemente básico (sempre carregado positivamente), utilize uma partícula de fase estacionária de troca catiônica fraca em pH > 7; isso garante uma superfície de partícula carregada negativamente. Para liberar ou eluir a base forte, diminua o pH da fase móvel para menos de 3; isso remove a carga da superfície e desliga o mecanismo de retenção de troca iônica.

Observe que um pK_a é o valor de pH no qual 50% do grupo funcional é ionizado e 50% é neutro. Para garantir uma superfície de analito ou partícula essencialmente neutra ou totalmente carregada, o pH deve ser ajustado para um valor de pelo menos 2 unidades além do pK_a, conforme apropriado (indicado na Tabela D).

Não utilize um trocador catiônico forte para reter uma base forte; ambos permanecem carregados e fortemente atraídos um pelo outro, tornando a base quase impossível de eluir. Ele só pode ser removido inundando o trocador catiônico forte com uma base concorrente que exibe uma retenção ainda mais forte e desloca o composto de interesse ao ganhar a competição para os locais de troca ativos. Essa abordagem raramente é prática ou segura em HPLC e SPE. (Ácidos e bases muito fortes são perigosos de trabalhar e podem ser corrosivos para materiais de construção utilizados em fluidos de HPLC!)

Separações baseadas no tamanho: Cromatografia de exclusão por tamanho (SEC, Size-Exclusion Chromatography) – Cromatografia de permeação em gel (GPC, Gel-Permeation Chromatography)

Na década de 1950, Porath e Flodin descobriram que as biomoléculas podiam ser separadas com base em seu tamanho, em vez de em sua carga ou polaridade, passando-as ou filtrando-as através de um polímero de dextrano hidrofílico de porosidade controlada. Esse processo foi denominado filtração de gel Posteriormente, um esquema análogo foi utilizado para separar oligômeros sintéticos e polímeros utilizando preenchimentos de polímero orgânico com intervalos de tamanho de poro específicos. Esse processo foi chamado de cromatografia de permeação em gel (GPC, Gel-Permeation Chromatography). Separações semelhantes feitas utilizando preenchimentos de sílica de porosidade controlada foram chamadas de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC, Size-Exclusion Chromatography). Lançados em 1963, os primeiros equipamentos de HPLC comerciais foram projetados para aplicações de GPC (consulte a Referência 3).

Todas essas técnicas são normalmente feitas em fases estacionárias que foram sintetizadas com uma distribuição de tamanho de poro ao longo de um intervalo que permite que os analitos de interesse entrem, ou sejam excluídos, mais ou menos do volume dos poros do preenchimento. Moléculas menores penetram mais nos poros em sua passagem pelo leito. Moléculas maiores só podem penetrar nos poros acima de um determinado tamanho, de forma que passam menos tempo no leito. As moléculas maiores podem ser totalmente excluídas dos poros e passar apenas entre as partículas, eluindo muito rapidamente em um pequeno volume. As fases móveis são escolhidas por dois motivos: em primeiro lugar, elas são bons solventes para os analitos; e, em segundo lugar, elas podem evitar quaisquer interações (com base na polaridade ou carga) entre os analitos e a superfície da fase estacionária. Dessa forma, as moléculas maiores eluem primeiro, enquanto as moléculas menores se deslocam mais lentamente (porque se movem para dentro e para fora de uma maior parte dos poros) e eluem mais tarde, em ordem decrescente de seu tamanho na solução. Assim, há a regra simples: os grandes saem primeiro.

Uma vez que é possível correlacionar o peso molecular de um polímero com seu tamanho em solução, a GPC revolucionou a medição da distribuição de peso molecular de polímeros que, por sua vez, determina as características físicas que podem aumentar ou diminuir a qualidade, o processamento e o desempenho do polímero (como distinguir o polímero bom do ruim).

Conclusão

Esperamos que tenha gostado desta breve introdução à HPLC. Recomendamos que você leia as referências e estude o Apêndice sobre Nomenclatura de HPLC.