Guia para iniciantes em cromatografia líquida

Na Figura H, três compostos de corante são representados por três picos separados no tempo no cromatograma. Cada um elui em um local específico, medido pelo tempo decorrido entre o momento da injeção (tempo zero) e o momento em que o pico máximo elui. Ao comparar o tempo de retenção de cada pico (t_R) com o de padrões de referência injetados no mesmo sistema cromatográfico (mesma fase móvel e estacionária), um cientista pode ser capaz de identificar cada composto.

No cromatograma mostrado na Figura I-1, o cientista sabia que, sob essas condições do sistema LC, o analito, a acrilamida, seria separado e eluído da coluna em 2,85 minutos (tempo de retenção). Sempre que uma nova amostra, que por acaso continha acrilamida, fosse injetada no sistema LC sob as mesmas condições, um pico estaria presente em 2,85 minutos (consulte a Amostra B na Figura I-2).

(Para uma melhor compreensão do motivo pelo qual alguns compostos se movem mais lentamente [são melhor retidos] do que outros, revise os modos de separação por HPLC).

Uma vez que a identidade é estabelecida, a próxima informação importante é quanto de cada composto estava presente na amostra. O cromatograma e os dados relacionados do detector nos ajudam a calcular a concentração de cada composto. O detector responde basicamente à concentração da faixa do composto conforme ela passa através da célula de fluxo. Quanto mais concentrado ela for, mais forte será o sinal; isso é visto como uma altura de pico maior acima da linha de base.

Na Figura I-2, os cromatogramas das Amostras A e B, na mesma escala de tempo, estão empilhados um acima do outro. O mesmo volume de amostra foi injetado em ambas as corridas. Ambos os cromatogramas exibem um pico em um tempo de retenção (t_R) de 2,85 minutos, indicando que cada amostra contém acrilamida. No entanto, a Amostra A exibe um pico muito maior para a acrilamida. A área sob um pico (contagem da área do pico) é uma medida da concentração do composto que ela representa. Esse valor de área é integrado e calculado automaticamente pela estação de dados do computador. Neste exemplo, o pico da acrilamida na Amostra A tem 10 vezes a área daquele da Amostra B. Utilizando padrões de referência, pode-se determinar que a Amostra A contém 10 picogramas de acrilamida, que é dez vezes a quantidade na Amostra B (1 picograma). Observe que há outro pico (não identificado) que elui em 1,8 minuto em ambas as amostras. Como as contagens de área para esse pico em ambas as amostras são aproximadamente as mesmas, esse composto desconhecido pode ter a mesma concentração em ambas as amostras.

Operação do sistema LC isocrático e de gradiente

Dois modos básicos de eluição são utilizados no HPLC. O primeiro é chamado de eluição isocrática. Nesse modo, a fase móvel, seja um solvente puro ou uma mistura, permanece a mesma durante toda a corrida. Um sistema típico é descrito na Figura J-1.

O segundo tipo é chamado de eluição de gradiente, em que, como seu nome indica, a composição da fase móvel muda durante a separação. Esse modo é útil para amostras que contêm compostos que abrangem uma ampla faixa de polaridade cromatográfica (consulte a seção Modos de separação por HPLC). Conforme a separação prossegue, a força de eluição da fase móvel é aumentada para eluir os componentes da amostra mais fortemente retidos.

No caso mais simples, mostrado na Figura J-2, há dois frascos de solventes e duas bombas. A velocidade de cada bomba é gerenciada pelo controlador de gradiente para fornecer mais ou menos de cada solvente ao longo do curso da separação. Os dois fluxos são combinados no misturador para criar a composição real da fase móvel que é fornecida à coluna ao longo do tempo. No início, a fase móvel contém uma proporção maior do solvente mais fraco (Solvente A). Com o tempo, a proporção do solvente mais forte (Solvente B) é aumentada, de acordo com um cronograma predeterminado. Observe que, na Figura J-2, o misturador está a jusante das bombas; assim, o gradiente é criado sob alta pressão. Outros sistemas HPLC são projetados para misturar vários fluxos de solventes sob baixa pressão, antes de uma única bomba. Uma válvula de dosagem de gradiente faz a seleção a partir dos quatro frascos de solvente, mudando a força da fase móvel ao longo do tempo (veja a Figura J-3).

Escala de HPLC (analítica, preparativa e de processo)

Discutimos como o HPLC fornece dados analíticos que podem ser utilizados para identificar e quantificar os compostos presentes em uma amostra. No entanto, o HPLC também pode ser utilizado para purificar e coletar as quantidades desejadas de cada composto, utilizando um coletor de frações a jusante da célula de fluxo do detector. Esse processo é chamado de cromatografia preparativa (veja a Figura K).

Na cromatografia preparativa, o cientista é capaz de coletar os analitos individuais conforme eles eluem da coluna (neste exemplo: amarelo, depois vermelho e depois azul).

O coletor de frações coleta seletivamente o eluato que agora contém um analito purificado, por um período especificado. Os recipientes são movidos de forma que cada um colete apenas um único pico de analito.

Um cientista determina os objetivos de quantidade e nível de pureza. Juntamente com o conhecimento da complexidade da amostra e da natureza e concentração dos analitos desejados em relação àquela dos constituintes da matriz, esses objetivos, por sua vez, determinam a quantidade de amostra que precisa ser processada e a capacidade necessária do sistema HPLC. Em geral, conforme o tamanho da amostra aumenta, o tamanho da coluna de HPLC se torna maior e a bomba precisará de uma capacidade de taxa de fluxo de volume maior. A determinação da capacidade de um sistema HPLC é chamada de seleção da escala de HPLC. A Tabela A lista várias escalas de HPLC e seus objetivos cromatográficos.

A capacidade de maximizar a seletividade com uma combinação específica de fases estacionárias e móveis de HPLC — alcançando a maior separação possível entre dois componentes de amostra de interesse — é fundamental para determinar os requisitos para aumentar o escalonamento de uma separação (consulte a discussão sobre os modos de separação por HPLC). Assim, a capacidade torna-se uma questão de escalonar o volume da coluna (V_c) para a quantidade de amostra a ser injetada e escolher um tamanho de partícula apropriado (determina a pressão e a eficiência; consulte a discussão sobre o poder de separação). O volume da coluna, uma função do comprimento do leito (L) e do diâmetro interno (DI), determina a quantidade de material de retenção (partículas) que pode ser contido (veja a Figura L).

Em geral, as colunas de HPLC variam de 20 mm a 500 mm de comprimento (L) e de 1 mm a 100 mm de diâmetro interno (DI). Conforme a escala de cromatografia aumenta, as dimensões da coluna também aumentam, especialmente a área da seção transversal. Para otimizar a produtividade, as taxas de fluxo da fase móvel devem aumentar em proporção à área da seção transversal. Se um tamanho de partícula menor for desejável para maior poder de separação, as bombas devem ser projetadas para sustentar taxas de fluxo de volume de fase móvel mais altas em alta contrapressão. A Tabela B apresenta algumas diretrizes simples sobre a seleção do intervalo de tamanho de partícula e do diâmetro interno da coluna recomendado para cada escala de cromatografia.

Por exemplo, uma aplicação em escala semipreparativa (X vermelho) utilizaria uma coluna com um diâmetro interno de 10 a 40 mm contendo partículas de 5 a 15 mícrons. O comprimento da coluna pode então ser calculado com base na quantidade de composto purificado que precisa ser processada durante cada corrida e na quantidade de poder de separação necessária.