Guia para iniciantes em cromatografia líquida

Os componentes de um sistema básico de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) são mostrados no diagrama simples na Figura E.

Um reservatório contém o solvente (chamado de fase móvel, porque ele se move). Uma bomba de alta pressão (sistema de fornecimento de solvente ou gerenciador de solvente) é utilizada para gerar e medir uma taxa de fluxo especificada de fase móvel, normalmente mililitros por minuto. Um injetor (gerenciador de amostras ou amostrador automático) é capaz de introduzir (injetar) a amostra no fluxo de fase móvel em circulação contínua que carrega a amostra para a coluna de HPLC. A coluna contém o material de retenção cromatográfico necessário para realizar a separação. Esse material de retenção é chamado de fase estacionária porque é mantido no lugar pelo hardware da coluna. É necessário um detector para ver as faixas de compostos separadas à medida que eluem da coluna de HPLC (a maioria dos compostos não tem cor, por isso, não podemos vê-los a olho nu). A fase móvel sai do detector e pode ser enviada para o descarte ou coletada, conforme desejado. Quando a fase móvel contém uma faixa de composto separada, a HPLC fornece a capacidade de coletar essa fração do eluato que contém esse composto purificado para fazer um estudo mais aprofundado. Isso é chamado de cromatografia preparativa (discutida na seção sobre Escala de HPLC).

Observe que a tubulação de alta pressão e as conexões são utilizadas para interconectar os componentes da bomba, do injetor, da coluna e do detector para formar o conduíte para a fase móvel, a amostra e as faixas de compostos separados.

O detector é conectado à estação de dados do computador, o componente do sistema HPLC que registra o sinal elétrico necessário para gerar o cromatograma em seu visor e para identificar e quantificar a concentração dos constituintes da amostra (consulte a Figura F). Como as características do composto de amostra podem ser muito diferentes, vários tipos de detectores foram desenvolvidos. Por exemplo, se um composto pode absorver luz ultravioleta, um detector de absorbância UV é utilizado. Se o composto tem fluorescência, um detector de fluorescência é utilizado. Se o composto não tem nenhuma dessas características, um tipo mais universal de detector é utilizado, como um detector de espalhamento de luz evaporativa (ELSD, Evaporative-Light-Scattering Detector). A abordagem mais eficiente é utilizar vários detectores em série. Por exemplo, um detector de UV e/ou ELSD pode ser utilizado em combinação com um espectrômetro de massas (MS, Mass Spectrometer) para analisar os resultados da separação cromatográfica. Isso fornece, a partir de uma injeção única, informações mais abrangentes sobre um analito. A prática de acoplar um espectrômetro de massas a um sistema HPLC é chamada de LC-MS.

Operação de HPLC

Uma maneira simples de entender como conseguimos a separação dos compostos contidos em uma amostra é visualizar o diagrama na Figura G.

A fase móvel entra na coluna pela esquerda, passa pelo leito de partículas e sai pela direita. A direção do fluxo é representada por setas verdes. Primeiro, considere a imagem superior; ela representa a coluna no tempo zero (momento da injeção), quando a amostra entra na coluna e começa a formar uma faixa. A amostra mostrada aqui, uma mistura de corantes amarelos, vermelhos e azuis, aparece na entrada da coluna como uma única faixa preta. (Na realidade, essa amostra pode ser qualquer coisa que possa ser dissolvida em um solvente; normalmente, os compostos seriam incolores e a parede da coluna opaca; portanto, precisaríamos de um detector para ver os compostos separados à medida que eluem.)

Após alguns minutos (imagem inferior), durante os quais a fase móvel flui constante e continuamente pelas partículas do material de retenção, podemos ver que os corantes individuais se moveram em faixas separadas em velocidades diferentes. Isso ocorre porque há uma competição entre a fase móvel e a fase estacionária para atrair cada um dos corantes ou analitos. Observe que a faixa do corante amarelo se move mais rápido e está prestes a sair da coluna. O corante amarelo gosta (é atraído pela) da fase móvel mais do que os outros corantes. Portanto, ele se move a uma velocidade mais rápida, mais próxima à da fase móvel. A faixa de corante azul gosta mais do material de retenção do que da fase móvel. Sua mais forte atração pelas partículas faz com que ele se mova significativamente mais lento. Em outras palavras, é o composto mais retido nesta mistura de amostras. A faixa de corante vermelho tem uma atração intermediária pela fase móvel e, portanto, move-se a uma velocidade intermediária através da coluna. Como cada faixa de corante se move a uma velocidade diferente, podemos separá-la cromatograficamente.

O que é um detector?

À medida que as faixas de corante separadas deixam a coluna, elas passam imediatamente para o detector. O detector contém uma célula de fluxo que vê (detecta) cada faixa de composto separada contra um background de fase móvel (consulte a Figura H). (Na realidade, as soluções de muitos compostos em concentrações analíticas de HPLC típicas são incolores.) Um detector apropriado tem a capacidade de detectar a presença de um composto e enviar seu sinal elétrico correspondente para uma estação de dados de computador. É feita uma escolha entre muitos tipos diferentes de detectores, dependendo das características e concentrações dos compostos que precisam ser separados e analisados, conforme discutido anteriormente.

O que é um cromatograma?

Um cromatograma é uma representação da separação que ocorreu quimicamente (cromatograficamente) no sistema HPLC. Uma série de picos subindo de uma linha de base é desenhada em um eixo de tempo. Cada pico representa a resposta do detector para um composto diferente. O cromatograma é representado em gráfico pela estação de dados do computador (veja a Figura H).

Na Figura H, a faixa amarela passou completamente pela célula de fluxo do detector; o sinal elétrico gerado foi enviado para a estação de dados do computador. O cromatograma resultante começou a aparecer na tela. Observe que o cromatograma começa quando a amostra foi injetada pela primeira vez e inicia como uma linha reta definida perto da parte inferior da tela. Isso é chamado de linha de base; representa a fase móvel pura que passa através da célula de fluxo ao longo do tempo. Conforme a faixa amarela do analito passa através da célula de fluxo, um sinal mais forte é enviado ao computador. A linha se curva, primeiro para cima e depois para baixo, em proporção à concentração do corante amarelo na faixa da amostra. Isso cria um pico no cromatograma. Depois que a faixa amarela passa completamente para fora da célula do detector, o nível do sinal retorna à linha de base; a célula de fluxo agora tem, mais uma vez, apenas fase móvel pura. Como a faixa amarela se move mais rápido, eluindo primeiro a partir da coluna, é o primeiro pico desenhado.

Um pouco mais tarde, a faixa vermelha atinge a célula de fluxo. O sinal sobe da linha de base quando a faixa vermelha entra pela primeira vez na célula, e o pico que representa a faixa vermelha começa a ser traçado. Neste diagrama, a faixa vermelha não passou totalmente pela célula de fluxo. O diagrama mostra como a faixa vermelha e o pico vermelho ficariam se interrompêssemos o processo neste momento. Como a maior parte da faixa vermelha passou pela célula, a maior parte do pico foi desenhada, conforme mostrado pela linha contínua. Se pudéssemos reiniciar, a faixa vermelha passaria completamente através da célula de fluxo e o pico vermelho seria concluído (linha pontilhada). A faixa azul, a mais fortemente retida, se desloca na taxa mais lenta e elui após a faixa vermelha. A linha pontilhada mostra como o cromatograma completo apareceria se tivéssemos deixado a corrida continuar até sua conclusão. É interessante notar que a largura do pico azul será a mais larga porque a largura da faixa do analito azul, embora seja mais estreita na coluna, torna-se a mais larga à medida que elui da coluna. Isso ocorre porque ele se move mais lentamente através do leito do material de retenção cromatográfico e requer mais tempo (e volume de fase móvel) para ser eluído completamente. Como a fase móvel flui continuamente a uma taxa fixa, isso significa que a faixa azul se alarga e é mais diluída. Como o detector responde em proporção à concentração da faixa, o pico azul é menor em altura, mas maior em largura.