Umfassender Leitfaden zur Hydrolyse und Analyse von Aminosäuren

Die Aminosäureanalyse durch Flüssigchromatographie und optische Detektion erfordert eine zusätzliche Probenvorbereitung, da die meisten Aminosäuren kein Chromophor besitzen und nicht detektiert werden können. Daher ist nach der Hydrolyse der nächste Schritt in der Aminosäureanalyse die Derivatisierung. Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung von Protein- oder Peptidhydrolysaten für die Derivatisierung mithilfe von Waters AccQ•Tag Chemistry.

Zur korrekten und zuverlässigen Derivatisierung einer hydrolysierten Probe muss Folgendes beachtet werden:

• Entfernung von Partikeln
• Bestimmung der Probenmasse für die Derivatisierung
• Bestimmung, ob Probenneutralisation erforderlich ist
• Verwendung von überschüssigem Derivatisierungsreagenz basierend auf der Probenmasse

Die folgenden Ausführungen wurden notgedrungen abgekürzt. Weitere Informationen und Anleitungen zur Derivatisierungschemie von AccQ•Tag finden Sie unter www.waters.com/AAA.

Eine Zentrifugation kann notwendig sein, wenn größere Mengen an Partikeln oder schwebenden Lipiden enthalten sind. Durch Zentrifugieren ist es einfacher, ein Aliquot des klaren Hydrolysats für die Derivatisierung zu entnehmen.

Bei Proben mit großem Volumen, z. B. bei Hydrolysaten zur Futtermittelanalyse, kann die Filtration der Partikel ausreichen. Dabei ist zu beachten, dass die Probenwiederfindung durch die Wahl des Filtermaterials beeinflusst werden kann. Dieser Faktor muss berücksichtigt werden, um unverfälschte Ergebnisse zu erhalten. Wenden Sie sich für nähere Informationen zur Filterleistung bei dieser Applikation an den Filterhersteller.

Die AccQ•Tag Methode ist eine Technik der Vorsäulenderivatisierung zur Aminosäureanalyse hydrolysierter Peptide und Proteine. Die AccQ•Tag Methode bewirkt Folgendes:

• Verwendet Waters AccQ•Tag Ultra oder AccQ•Fluor Reagent zur Derivatisierung der Aminosäuren
• Trennt die Derivate mittels Gradienten-basierter Umkehrphasen-HPLC oder -UPLC
• Quantifiziert die Derivate genau mithilfe externer Aminosäurestandards und optischer Detektion

Das 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AQC)-Reagenz reagiert sowohl mit primären als auch mit sekundären Aminen. Überschüssiges AQC-Reagenz reagiert mit Wasser zu 6-Aminochinolin (AMQ). AMQ reagiert langsam mit überschüssigem AQC-Reagenz zu einem Bisharnstoff. Diese Nebenprodukte stören die Trennung, Identifizierung und Quantifizierung der Aminosäuren, die in den Peptid- oder Proteinhydrolysaten enthalten sind, nicht. Die Derivate sind tagelang stabil, sodass bei Bedarf eine Batch-Verarbeitung oder eine Wiederholung der Analyse möglich ist.

Über viele Jahre wurden umfangreiche Studien durchgeführt, um die Genauigkeit der AccQ•Tag Ableitungsreaktion sicherzustellen. Die chemische Reaktion selbst erfordert für die vollständige Derivatisierung aller Aminosäuren sowohl einen molaren Überschuss des Derivatisierungsreagenzes als auch einen basischen pH-Wert (8–10). Es wurden Strategien entwickelt, um diesen kritischen Faktoren zu begegnen.

Bei der Reaktion selbst wird die Probe in der Regel 10x verdünnt und 1 µL von insgesamt 100 µL Derivatisierungsvolumen wird auf die Säule injiziert. Da bei einer Derivatisierung nicht alle Aminosäuren in derselben Menge vorhanden sind, muss die Probenmenge so groß sein, dass die Aminosäure mit der kleinsten Fraktion die Nachweis- oder Bestimmungsgrenze beeinflusst. Für eine genaue Quantifizierung wird die Derivatisierung von mindestens 1 pmol der Aminosäure mit der kleinsten Fraktion in einem maximalen Injektionsvolumen von 1 µL empfohlen. Um die benötigte Probenmenge zu bestimmen, führen Sie die folgende Berechnung durch:

Beispielrechnung:
Für eine Probenkonzentration von 1,0 mg/mL Protein:
Schätzen Sie die Probenmenge ab, die für die Aminosäure mit der kleinsten Fraktion benötigt wird. In diesem Beispiel gehen wir davon aus, dass 0,03 mg/mL benötigt werden, um 1 pmol dieser Aminosäure auf der Säule abzugeben.

Rechnen Sie mg in Mol um (das mittlere Molekulargewicht eines Aminosäurerests in einem Protein ist 110).

Dies ist die geschätzte Konzentration der Aminosäure mit der kleinsten Fraktion in dieser Probe.

Dies ergibt eine 27-fache Verdünnung (10 ÷ 0,37 = 27).

Das Hydrolysat muss vor der Derivatisierung 27-fach verdünnt werden. Zum Beispiel: 5 µL des Probenhydrolysats können mit 135 µL von 0,1 N HCl verdünnt werden, um diesen Zielwert zu erhalten.

Schließlich kann ein 10-µL-Aliquot der obigen Verdünnung in das Derivatisierungsvial überführt werden.

Um eine vollständige Derivatisierung der im Hydrolysat enthaltenen Aminosäuren mit dem AccQ•Tag Reagenz sicherzustellen, muss die Probe in einem ungefähren pH-Bereich von 8,2 bis 10,1 gepuffert werden. Wenn das Säurehydrolysat nicht ordnungsgemäß neutralisiert wird und der pH-Wert unter 8,2 fällt, ist die Derivatisierung unvollständig. Der Einfluss des pH-Werts ist für jede Aminosäure unterschiedlich. Beachten Sie, dass nicht alle Aminosäuren gleichermaßen betroffen sind. Saure Aminosäuren wie Glutaminsäure und Alanin sind stärker betroffen als Serin oder Phenylalanin. Der pH-Wert ist ein entscheidender Faktor für die genaue Quantifizierung aller Aminosäuren in der Originalprobe.

• Wenn die Aminosäurelösung in 0,1 N HCl gelöst wird, können 10 bis 20 µL der Probe ohne pH-Einstellung direkt in die Derivatisierungsmischung überführt werden. Hinweis: Es muss weiterhin sichergestellt werden, dass das verfügbare Derivatisierungsreagenz   im Überschuss vorhanden ist, wie unten beschrieben.
• Wenn die Aminosäurelösung eine höhere Säurekonzentration aufweist (> 0,1 N HCl), sollte sie mit einem gleichen Volumen an Natriumhydroxid derselben Konzentration neutralisiert werden. Dies kann entweder als Massenzugabe oder integriert in den Derivatisierungsschritt erfolgen.
  • Ersetzen Sie die erforderliche Menge Boratpuffer durch NaOH, um die HCl in der Probe zu neutralisieren.
  • Geben Sie in die Vial-Mischung für die Derivatisierung 10 µL xM NaOH und 60 µL Borat. Fügen Sie 10 µL der AA-Probe hinzu (in xN HCl). Derivatisieren Sie mit 20 µL AccQ•Fluor Reagenz.
• Wenn Sie Zweifel haben, ob die Neutralisation korrekt erfolgt ist, können Sie Testproben vorbereiten und den endgültigen pH-Wert mit Einweg-pH-Streifen überprüfen.

WARNUNG: Wenn sich die Probe nach der Zugabe des Derivatisierungsreagenz  hellgelb färbt, ist der pH-Wert der Probe zu niedrig. Neutralisieren Sie mit NaOH.

Beispielrechnung:
Um die für die Neutralisation benötigte Menge an NaOH zu bestimmen, führen Sie die folgende Berechnung durch.
Für die obige Proteinprobe mit 1,0 mg/mL in 6 N HCl, die 27-fach verdünnt werden muss, um sicherzustellen, dass die Probe genügend überschüssiges Derivatisierungsreagenz enthält, gelten die folgenden Berechnungen.

Rechnen Sie die Säurekonzentration der Probe von Mol in µmol um:

Bestimmen Sie die Endkonzentration der Säure in der verdünnten Probe:

Zur Erinnerung: 5 µL des Probenhydrolysats können mit 135 µL von 0,1 N HCl verdünnt werden, um diesen Zielwert zu erhalten.

Die Gesamtmenge an NaOH, die pro Derivatisierung benötigt wird, beträgt 0,31 M.

Da der Derivatisierung insgesamt ein Boratpuffer von 70 µL hinzugefügt wird, gibt es zwei Methoden zur Neutralisierung:

Fügen Sie 10 µL 0,31 M NaOH und 60 µL Puffer für jede Derivatisierung hinzu.

Mischen Sie in einem separaten Vial 600 µL Boratpuffer und 100 µL 0,31 M NaOH. Mischen Sie. Geben Sie 70 µL dieser Mischung + 10 µL Probe + 20 µL AccQ•Tag Derivatisierungsreagenz für jede Probe hinzu.

Für eine vollständige Derivatisierung aller Aminosäuren wird in der Reaktion ein 4- bis 6-facher molarer Überschuss des AccQ•Tag Derivatisierungsreagenz benötigt. Wenn das Reagenz nicht ausreicht, werden einige relativ empfindliche Aminosäuren nicht vollständig derivatisiert. Die Derivatisierungsraten für jede Aminosäure variieren je nach den chemischen Eigenschaften der Aminosäuren; zum Beispiel kann die Wiederfindung von Alanin durch einen unzureichenden molaren Überschuss von AccQ•Tag erheblich beeinträchtigt werden, während Phenylalanin gegen diese Effekte immuner ist.

Um die Probenmenge zu bestimmen, die in das Reagenzvial gegeben wird, muss die Reagenzmenge in jedem Vial bekannt sein. Das Standard AccQ•Tag Reagenzvial enthält 3 – 4 mg Reagenz, was etwa 10 – 14 µmol Reagenz entspricht. Da das Reagenz in 1 mL Acetonitril gelöst wird und 20 µL für jede 100 µL-Derivatisierungsreaktion verwendet werden, enthält jeder Reaktionsbehälter 210–280 nmol an Derivatisierungsreagenz.

Da jedes Reaktionsvial 210–280 nmol Reagenz enthält und wir für jede Probe den 4- bis 6-fachen molaren Überschuss benötigen, sollte die Gesamtmenge an Aminen in jeder Reaktion nicht kleiner sein als 40–140 nmol.

Beispielrechnung:
Bei einer Proteinprobe verwenden Sie das Probengewicht und das durchschnittliche Gewicht einer Aminosäure, um den erforderlichen Überschuss abzuschätzen.

Bei einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 110 wird die Proteinmenge in der Probe wie folgt bestimmt:

wobei MW in Einheiten von g/mol in µg/µmol umgewandelt wird und

    1 mL = 103 µL

    1 mmol = 103 µmol = 106 nmol

Sobald die molare Konzentration bestimmt ist, wird die Menge an Aminosäuren in der Probe berechnet.

Unter Verwendung des 1-mg/mL-Proteins in Schritt 1, das eine 27-fache Verdünnung (5 µL Hydrolysat-Stammlösung + 135 µL Puffer) aus Abschnitt 6.3.1 erforderte, werden nmol in 10 µL der verdünnten Probe wie folgt berechnet:

3,3 nmol liegt weit unter der Grenze von 140 nmol, so dass die Probe akzeptabel ist.

Die HPLC AccQ•Tag Methode, die 1992 von der Waters Corporation auf den Markt gebracht wurde, verwendet denselben Derivatisierungsschritt vor der Säule wie die AccQ•Tag Ultra Methode, die 2006 eingeführt wurde. Das AccQ•Fluor Reagenz 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AQC) derivatisiert primäre und sekundäre Amine in einer einfachen einstufigen Reaktion zu hochstabilen Fluoreszenzaddukten. Wir bieten die AccQ•Tag Methode als Systempaket an, das abgepackte Reagenzien und eine ausführliche Dokumentation enthält. Das AccQ•Tag Chemistry Package enthält die Komponenten, die für bis zu 250 Analysen von Aminosäuren aus Protein- und Peptidhydrolysat benötigt werden.

Das AccQ•Tag Derivatization Kit enthält fünf Sätze von Derivatisierungsreagenzien. Jeder Reagenziensatz enthält jeweils ein Vial der folgenden Komponenten:

• AccQ•Fluor Boratpuffer – wird den Proben zugesetzt, um einen optimalen pH-Wert für die Derivatisierung sicherzustellen
• AccQ•Fluor Reagenzpulver – 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AQC) Derivatisierungsreagenz (trocken geliefert für maximale Stabilität)
• AccQ•Fluor Reagent Diluent – Acetonitril wird verwendet, um das Reagenz für die Derivatisierung zu rekonstituieren

Die UPLC Amino Acid Analysis Solution von Waters ist ganzheitlich konzipiert für schlüsselfertige Aminosäureanalysen. Vorsäulenderivatisierte Aminosäuren werden auf einem Waters ACQUITY UPLC System unter Verwendung der mitgelieferten AccQ•Tag Ultra, Umkehrphasen-UPLC-Säule, Eluenten und Methoden aufgelöst. Eine robuste Derivatisierungschemie, stabile chromatographische Basislinien und eine überragende Aminosäureauflösung tragen zur Gewährleistung genauer, präziser und konsistenter quantitativer Ergebnisse bei.

Die UPLC Amino Acid Analysis Solution umfasst:

• Waters AccQ•Tag Ultra Chemie-Zubehör, einschließlich Säule, Reagenzien und Eluenten – alle auf Qualität mit Applikation der Aminosäureanalyse getestet
• Software Empower 2, vorkonfigurierte Projekte, Methoden und Reportformate
• Ausführliche Dokumentation des Systems und der Applikation

Das Waters ACQUITY UPLC System unterstützt drei verschiedene optische Detektoren: abstimmbarer UV-, PDA- und Fluoreszenzdetektor.

Die UPLC Amino Acid Analysis Solution umfasst zwei vollständige Methoden, die dieselben Geräte und Materialien verwenden. Die erste ist für Aminosäuren geeignet, die aus Proteinhydrolysaten abgeleitet sind. Die zweite ist für die größere Anzahl freier Aminosäuren geeignet, die in Prozessproben wie Zellkulturen oder Fermentationsbrühen gefunden werden. Die Methoden unterscheiden sich in der Verdünnung des AccQ•Tag Ultra Eluenten A und der Trennsäulentemperatur. Es gibt keine Anpassungen des pH-Werts oder Modifikationen der Zusammensetzung durch den Benutzer, weder für Eluent A noch für Eluent B.

Die Aminosäureanalyse von Proteinen wird sowohl als Teil einer Strukturbestimmung als auch als Maß für die Gesamtproteinmenge in einer Probe verwendet. Die Probe wird vor der Analyse hydrolysiert. Für Strukturanalysen werden die beobachteten Molverhältnisse der Aminosäuren mit den aus der Sequenz erwarteten Werten verglichen.

Für Proteinmengen werden die Gewichte der Aminosäuren aufsummiert. Dieses Maß der Proteinkonzentration wird zur Berechnung der Extinktionskoeffizienten verwendet, wenn die Probenzusammensetzung gebräuchliche Proteinassays stört. Sowohl der Gewichtsprozentsatz jeder Aminosäure als auch die Gesamtproteinmasse werden verwendet, um den Nährwertgehalt von Lebensmitteln und Futtermitteln zu beurteilen. Die UPLC Amino Acid Analysis Solution von Waters bietet robuste Routineanalysen für alle diese Applikationen.