Umfassender Leitfaden zur Hydrolyse und Analyse von Aminosäuren

Lebens- und Futtermittel bestehen aus chemischen Verbindungen, die essentielle Aminosäuren für Wachstum und Ernährung enthalten. Die Analyse des Aminosäuregehalts ist wichtig, um die richtige Ernährung sicherzustellen. Diese Produkte werden jedoch in Bulk-Prozessen hergestellt. Wie bei der pharmazeutischen Produktion können Bulk-Prozesse während eines Produktionslaufs in ihrer Leistung schwanken. Es muss beachtet werden, was eine repräsentative Probe darstellt. In der Regel ist eine Stichprobenstrategie erforderlich. Die Aminosäureanalyse dieser Produkte erfordert mehrere Ansätze, um die Zusammensetzung des Gesamtproteins der Proben richtig zu analysieren. Da Lebens- und Futtermittel in großen Mengen hergestellt werden und Nicht-Protein-Bestandteile enthalten, wird die Flüssighydrolyse empfohlen.

Hinweis: Die schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin sowie die Aminosäure Tryptophan sind bei der Standard-Säurehydrolyse nicht stabil. Es können alternative Methoden eingesetzt werden, um diese Aminosäuren effektiv zu analysieren.

In diesem Abschnitt stellen wir drei verschiedene Hydrolyseverfahren vor:

• Säurehydrolyse – zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts und der Zusammensetzung
• Oxidation mit Perameisensäure – zur Messung der schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin
• Alkalische Hydrolyse – zur Beurteilung der Wiederfindung von Tryptophan

Bei der Analyse von in Proteinen gebundenen Aminosäuren müssen die Peptidbindungen aufgebrochen werden, um die Aminosäuren für die Analyse freizusetzen (Abbildung 1). Bei zu hydrolysierenden Futterproteinproben sollten der pH-Wert des Probenmaterials und das Vorhandensein von Feststoffen berücksichtigt werden. Wie in den vorherigen Abschnitten erwähnt, variiert die Geschwindigkeit oder die Länge der Hydrolyse bei den in Proteinen vorhandenen Aminosäuren. Dies gilt insbesondere für in Lebensmitteln gebundenen Proteine. Wie bei jeder Hydrolysemethode müssen die gewählten Parameter das Ergebnis sorgfältiger Experimente sein.

Bei der Analyse von Futtermitteln müssen drei Faktoren der Probenvorbereitung beachtet werden:

1. Probenverarbeitung
2. Hydrolysierte Probenmenge
3. Für die Hydrolyse verwendetes Säurevolumen

3.2.1 Probenverarbeitung

Futtergetreide und ähnliche Proben sind normalerweise nicht einheitlich. Um sie so einheitlich wie möglich zu machen, sollten die Proben zu einem feinen Pulver gemahlen werden. Proben mit hohem Fettgehalt können vor dem endgültigen Vermahlen durch Standardverfahren entfettet werden. Ein feines Pulver ermöglicht eine effektive Hydrolyse der Futterproteine. Die AOAC-Methode (4.1.11, 994.12b, J.AOAC Int. 88, 2005, Amino Acid Analysis of Feeds) sieht vor, dass die Probe so lange gemahlen wird, bis sie durch ein 0,25-mm- oder 60-US-Mesh-Sieb (Partikelgröße von 250 µm) passt.

3.2.2 Probenmenge

Die AOAC-Methode für die Futtermittelanalyse von Aminosäuren empfiehlt die folgende Berechnung zur Bestimmung der Probenmenge, die für eine Futtermittelanalyse verwendet wird.

Berechnen Sie die ungefähre Menge der zu verwendenden Testportion wie folgt:

Ws = 1000/Ns

wobei Ns = Stickstoffgehalt der Testportion (%) und Ws = Gewicht des Testmaterials, äquivalent zu 10 mg Stickstoffgehalt (mg).

Im Allgemeinen liegt dieser im Bereich von 100 bis 1000 mg des Materials für jede analysierte Probe.

3.2.3 Säurevolumen

Wie bereits erwähnt, ist für eine effektive Hydrolyse von Proteinproben ein großer Gewichtsüberschuss an Säure erforderlich. Bei Futtermitteln ist dies nicht anders. Im Gegensatz zu dem in Abschnitt 2.1.2 erörterten 100-fachen Überschuss liegt das Verhältnis von zugesetzter Säure zum Probengewicht bei der AOAC-Methode 994.12 zwischen dem 50- und 500-fachen. Diese Spanne und das Vorhandensein von partikelförmigen Bulk-Nicht-Protein-Materialien in Futtermitteln machen deutlich, dass vor der routinemäßigen Verwendung für die Futtermittelanalyse eine sorgfältige Studie zur Bereichsfindung durchgeführt werden muss.

3.2.4 Interne Standards

Die Verwendung eines internen Standards (IS) kompensiert am besten die variable Hydrolyse der einzelnen Aminosäuren der Probe. Waters empfiehlt die Verwendung von Norvalin (Nva) als IS für AccQ•Tag Ultra in der UPLC und Alpha-Aminobuttersäure (AABA) oder Norleucin für AccQ•Tag in der HPLC. Der in der AOAC-Methode 994.12 für die Futtermittelanalyse empfohlene interne Standard ist Norleucin. Bei der Auswahl eines IS sollte vorsichtig vorgegangen werden, um sicherzustellen, dass die gewünschten Auflösungen zwischen den Aminosäurepeaks in der Chromatographie erreicht werden.

3.2.5 AOAC 994.12 Amino Acids in Feeds

In der Literatur finden Sie zahlreiche Methoden, die auf die Analyse von Aminosäuren in Futtermitteln angewendet werden können. Die hier vorgestellte Methode ist an die AOAC-Methode 994.12 Amino Acids in Feeds (Aminosäuren in Futtermitteln) angepasst.

• Analysenwaage, Ablesbarkeit ±0,1 mg
• Waage, Beladung von oben
• Flasche, 50 mL; Polyethylen
• Aufschlussröhrchen und Siedekolben sind geeignet
• Aufschlussblock, Heizmantel oder Wasserbad sind geeignet
• Filtereinheiten, 0,22 µm (Millex GS, Millipore sind geeignet)
• pH-Messgerät, kalibriert mit Puffern von pH 2,0, 4,0 und 7,0
• Rückflusskühler
• Rotationsverdampfer
• Bechergläser, 250 und 1000 mL
• Erlenmeyerkolben, 150 mL
• Rundkolben, 1000 mL
• Messzylinder, 100, 500 und 1000 mL
• Messkolben, 1000 mL
• Vollpipetten, 10 und 20 mL
• Sinterglasfilter, Porosität 10 – 15 µm
• Spritzen

• DL-Norleucin, Kristalle
• Salzsäure, konzentriert
• Natriumhydroxid, 30 %ige Lösung (30 g/100 mL)
• Phenol, Kristalle
• Thiodiglykol, 98 %ige Lösung
• Tri-Natriumcitrat-Dihydrat
• pH-Puffer, pH 2,0, 4,0 und 7,0

Natriumcitrat-Puffer – pH 2,20

1. Wiegen Sie 19,60 g Tri-Natriumcitrat ein und dihydrieren Sie es in einem 1000-mL-Becherglas.
2. Lösen Sie es in ca. 800 mL H₂O auf.
3. Fügen Sie unter Rühren 10 mL einer 98%igen Thiodiglykol-Lösung und 15 mL HCl hinzu.
4. Übertragen Sie die Lösung quantitativ in einen 1000-mL-Messkolben und verdünnen Sie sie mit H₂O.
5. Filtrieren Sie die Pufferlösung durch einen Sinterglasfilter.
6. Passen Sie den pH-Wert mit HCl oder 2 M NaOH auf 2,20 an.

6 M HCl-Phenollösung

1. Wiegen Sie 1 g Phenolkristalle in ein tariertes 1000-mL-Becherglas ein.
2. Lösen Sie die Kristalle in 500 mL H₂O auf. Fügen Sie unter Rühren langsam 500 mL HCl hinzu.

Salzsäurelösung – 1 M

1. Gießen Sie ca. 800 mL H₂O in einen 1000-mL-Messkolben.
2. Fügen Sie mit einer Pipette 83,3 mL HCl hinzu.
3. Verdünnen Sie mit H₂O bis zur Markierung und mischen Sie gründlich.

Salzsäurelösung – 0,1 M

1. Gießen Sie ca. 800 mL H₂O in einen 1000-mL-Messkolben.
2. Fügen Sie mit einer Pipette 100 mL 1 M HCl hinzu.
3. Verdünnen Sie mit H₂O bis zur Markierung und mischen Sie gründlich.

Natriumhydroxidlösung (2 M NaOH)

1. Wiegen Sie 80,0 g NaOH in ein tariertes 1000-mL-Becherglas ein.
2. Lösen Sie die Pellets in einem Becherglas in ca. 600 mL H₂O langsam auf.
3. Lassen Sie die Lösung abkühlen und übertragen Sie sie quantitativ in einen 1000-mL-Messkolben.
4. Verdünnen Sie sie mit H₂O bis zur Markierung und mischen Sie sie gründlich.

Interne Standardlösung

1. Wiegen Sie 195 bis 200 mg DL-Norleucinkristalle in einem tarierten 150-mL-Erlenmeyerkolben ein.
2. Lösen Sie sie mit 100 mL 1 M HCl auf.
3. Übertragen Sie die Lösung quantitativ in einen 1000-mL-Messkolben und verdünnen Sie sie mit H₂O.

1. Wiegen Sie 100 bis 1000 mg der fein gemahlenen Probe bis auf 0,1 mg (entspricht ca. 10 mg Stickstoffgehalt) in beschriftete Aufschlussröhrchen ein. Verwenden Sie die im obigen Abschnitt beschriebene Berechnung, um die tatsächlich zu verwendende Probenmenge zu bestimmen.
2. Fügen Sie 50 mL 6 M HCl-Phenollösung zum abgewogenen Teil hinzu und rühren Sie kurz um. Fügen Sie der Lösung 2 – 3 Siedesteine hinzu.
3. Hydrolysieren Sie sie unter einer Abzugshaube unter Rückfluss 24 Stunden lang bei 110 – 120 °C unter Verwendung eines Heizblocks oder eines Wasserbads, der bzw. das der Temperatur angepasst ist.
4. Nehmen Sie die Aufschlussröhrchen vom Heizblock oder aus dem Waaserbad und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab.
5. Fügen Sie jeder Testlösung mit einer Vollpipette 20 mL interne Norleucin-Standardlösung hinzu. Mischen Sie die Lösungen durch Schwenken der Kolben.
6. Filtrieren Sie die Hydrolysate durch einen Sinterglasfilter in beschriftete 1000-mL-Rundkolben.
7. Schließen Sie die Kolben an einen Rotationsverdampfer an und dampfen Sie sie bei 60 °C zur Trockenheit ein.
8. Spülen Sie durch Zugabe von etwa 20 mL H₂O und wiederholen Sie den Verdampfungsschritt. Wiederholen Sie die Spül- und Verdampfungsschritte zweimal.
9. Nehmen Sie den Kolben vom Verdampfer.
10. Fügen Sie 50 mL Natriumcitrat-Puffer zum eingedampften Hydrolysat hinzu, mischen Sie es gut und übertragen Sie es in eine beschriftete 50-mL-Polyethylenflasche.
11. Die Probe kann nun für die Derivatisierung vorbereitet werden.

Cystein und Methionin sind bei der Analyse von Futtermitteln entscheidende Aminosäuren; beide wirken sich auf die Tiere, die das Futter verzehren, wachstumshemmend aus. Da die Standardbedingungen der Säurehydrolyse für diese Aminosäuren nicht funktionieren, wird üblicherweise eine alternative Oxidation mit Perameisensäure durchgeführt. Dieser Ansatz wandelt Cystein und Cystin in Cyanursäure und Methionin in Methioninsulfon um (Abbildung 3). Die Proben können dann wirksam säurehydrolysiert und derivatisiert werden.

In der Literatur gibt es mehrere Versionen der Oxidation mit Perameisensäure. Obwohl die Prozesse insgesamt ähnlich sind, unterscheiden sie sich im Einzelnen. In dieser Anleitung werden zwei Methoden als möglicher Ausgangspunkt vorgestellt. Die erste Methode stammt von der AOAC 994.12. Die zweite ist eine alternative Methode, die auf MacDonald et al., 1985, basiert. Bevor Sie sich auf einen bestimmten Ansatz festlegen, ist eine sorgfältige Bewertung und Optimierung erforderlich.

• Analysenwaage, Ablesbarkeit ±0,1 mg
• Waage, Beladung von oben
• Flasche, 50 mL; Polyethylen
• Aufschlussröhrchen und Siedekolben sind geeignet
• Aufschlussblock, Heizmantel oder Wasserbad sind geeignet
• Filtereinheiten, 0,22 µm (Millex GS, Millipore sind geeignet)
• pH-Messgerät, kalibriert mit Puffern von pH 2,0, 4,0 und 7,0
• Rückflusskühler
• Rotationsverdampfer
• Bechergläser, 250 und 1000 mL
• Erlenmeyerkolben, 150 mL
• Rundkolben, 1000 mL
• Messzylinder, 100, 500 und 1000 mL
• Messkolben, 1000 mL
• Vollpipetten, 10 und 20 mL
• Sinterglasfilter – Porosität 10 – 15 µm
• Eisbad
• Spritzen

• Ameisensäure, 88 %
• Wasserstoffperoxid, 30 %
• Natriummetabisulfit
• DL-Norleucin, Kristalle
• Salzsäure, konzentriert
• Natriumhydroxid, 30 %ige Lösung (30 g/100 mL)
• Phenol, Kristalle
• Thiodiglykol, 98 %ige Lösung
• Tri-Natriumcitrat-Dihydrat
• pH-Puffer, pH 2,0, 4,0 und 7,0

Natriumcitratpuffer – pH 2,20

1. Wiegen Sie 19,60 g Tri-Natriumcitrat ein und dihydrieren Sie es in einem 1000-mL-Becherglas.
2. Lösen Sie es in ca. 800 mL H₂O auf.
3. Fügen Sie unter Rühren 10 mL einer 98%igen Thiodiglykol-Lösung und 15 mL HCl hinzu.
4. Übertragen Sie die Lösung quantitativ in einen 1000-mL-Messkolben und verdünnen Sie sie mit H₂O.
5. Filtrieren Sie die Pufferlösung durch einen Sinterglasfilter.
6. Passen Sie den pH-Wert mit HCl oder 2 M NaOH auf 2,20 an.

6 M HCl-Phenollösung

1. Wiegen Sie 1 g Phenolkristalle in ein tariertes 1000-mL-Becherglas ein.
2. Lösen Sie die Kristalle in 500 mL H₂O auf. Fügen Sie unter Rühren langsam 500 mL HCl hinzu.

Salzsäurelösung – 1 M

1. Gießen Sie ca. 800 mL H₂O in einen 1000-mL-Messkolben.
2. Fügen Sie mit einer Pipette 83,3 mL HCl hinzu.
3. Verdünnen Sie mit H₂O bis zur Markierung und mischen Sie gründlich.

Salzsäurelösung – 0,1 M

1. Gießen Sie ca. 800 mL H₂O in einen 1000-mL-Messkolben.
2. Fügen Sie mit einer Pipette 100 mL 1 M HCl hinzu.
3. Verdünnen Sie mit H₂O bis zur Markierung und mischen Sie gründlich.

Natriumhydroxidlösung (2 M NaOH)

1. Wiegen Sie 80,0 g NaOH in ein tariertes 1000-mL-Becherglas ein.
2. Lösen Sie die Pellets in einem Becherglas in ca. 600 mL H₂O langsam auf.
3. Lassen Sie die Lösung abkühlen und übertragen Sie sie quantitativ in einen 1000-mL-Messkolben.
4. Verdünnen Sie sie mit H₂O bis zur Markierung und mischen Sie sie gründlich.

Interne Standardlösung

1. Wiegen Sie 195 – 200 mg DL-Norleucinkristalle in einem tarierten 150-mL-Erlenmeyerkolben ein.
2. Lösen Sie sie mit 100 mL 1 M HCl auf. Übertragen Sie die Lösung quantitativ in einen 1000-mL-Messkolben und verdünnen Sie sie mit H₂O.

Perameisensäure-Reagenz

1. Bereiten Sie es im Abzug vor. Wiegen Sie 25 mg Phenolkristalle in ein 25-mL-Teströhrchen ein.
2. Fügen Sie mit einer Mikropipette 0,5 mL von 30 %igem H₂O₂ hinzu.
3. Geben Sie 4,5 mL von 88%iger Ameisensäure hinzu.
4. Decken Sie das Teströhrchen mit einem Stopfen ab und lassen Sie das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
5. Legen Sie die Teströhrchen nach 30 Minuten in ein Eisbad und kühlen Sie das Perameisensäure-Gemisch 15 Minuten lang ab.
6. Bereiten Sie das Reagenz unmittelbar vor der Verwendung vor.

1. Wiegen Sie 100 – 1000 mg der fein gemahlenen Probe bis auf 0,1 mg (entspricht etwa 10 mg Stickstoffgehalt) in beschriftete Hydrolyseröhrchen ein. Verwenden Sie die zuvor beschriebene Berechnung, um die tatsächlich zu verwendende Probenmenge zu bestimmen.
2. Setzen Sie in jedes Röhrchen einen Magnetrührer und stellen Sie die Aufschlussröhrchen in ein Eisbad (0 °C).
3. Nachdem sowohl die Perameisensäure als auch die Testportion mindestens 15 Minuten abgekühlt sind, geben Sie 5 mL des Perameisensäure-Reagenzes in jedes Aufschlussröhrchen; verschließen Sie alle Röhrchen mit einem Stopfen oder einer Kappe und rühren Sie 15 Minuten lang.
4. Stellen Sie die Aufschlussröhrchen wieder in das Eisbad und lassen Sie die Proben 16 Stunden oxidieren.
5. Entfernen Sie die Glasstopfen und fügen Sie etwa 0,84 g Natriummetabisulfit hinzu, um die Perameisensäure zu zersetzen. Rühren Sie für 15 Minuten, um SO₂ freizusetzen.
6. Die Probe ist jetzt bereit für die Säurehydrolyse.

1. Geben Sie 50 mL einer 6 N HCl-Phenollösung zum abgewogenen Teil und rühren Sie kurz um. Fügen Sie der Lösung 2 – 3 Siedesteine hinzu.
2. Hydrolysieren Sie sie unter einer Abzugshaube unter Rückfluss für 24 Stunden bei 110 – 120 °C unter Verwendung eines Heizblocks oder eines Wasserbads, das der Temperatur angepasst ist.
3. Nehmen Sie die Aufschlussröhrchen vom Heizblock oder aus dem Waaserbad und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab.
4. Fügen Sie jeder Testlösung mit einer Vollpipette 20 mL interne Norleucin-Standardlösung hinzu. Mischen Sie die Lösungen durch Schwenken der Kolben.
5. Fahren Sie mit den Schritten (a–d) oder (e–g) unten fort.
   1. Filtrieren Sie die Hydrolysate durch einen Sinterglasfilter in beschriftete 1000-mL-Rundkolben.
   2. Schließen Sie die Kolben an einen Rotationsverdampfer an und dampfen Sie unter Vakuum bei 40 °C auf etwa 0,5 mL ein Hinweis: Dampfen Sie die Lösung nicht zur Trockenheit ein.
   3. Nehmen Sie den Kolben vom Verdampfer.
   4. Fügen Sie 50 mL Natriumcitrat-Puffer zum eingedampften Hydrolysat hinzu, mischen Sie es gut und übertragen Sie es in eine beschriftete 50-mL-Polyethylenflasche.
   5. Filtrieren Sie die Hydrolysate durch einen Sinterglasfilter in eine 250-mL-Saugflasche und übertragen Sie das Filtrat in ein 250-mL-Becherglas.
   6. Stellen Sie das Becherglas in ein Eisbad.
   7. Neutralisieren Sie die Hydrolysate teilweise mit ca. 40 mL 7,5 M NaOH, während Sie rühren. (Hinweis: Temperatur darf 40 °C nicht überschreiten.) Passen Sie den pH mit 2 M NaOH auf 2,20 an.

     6. Die Probe kann nun für die Derivatisierung vorbereitet werden.

Hinweis: In der Literatur finden Sie viele verschiedene Referenzen für diesen Test. Über die Mengen an Perameisensäure und Bromwasserstoff oder die Verdampfungstemperatur herrscht keine Einigkeit. Eine Änderung der Mengen und/oder der Temperatur wirkt sich auf die Verdampfungsdauer in Schritt 7 aus.

• 25 x 150 mm Röhrchen mit Kappen
• Eis und Eisbad
• Vollpipetten
• Vakuumverdampfer
• Saubere Stickstoffquelle
• Ofen oder Wärmeblock
• Volumetrische Glasgeräte
• Perameisensäure
• Wasserstoffperoxid
• Ameisensäure
• Ultrareines Wasser
• HBr-Lösung, 48 Gew.-%

1. Fügen Sie ein Volumen 30%iges Wasserstoffperoxid zu neun Volumen 88%iger Ameisensäure hinzu.
2. Lassen Sie die Mischung eine Stunde lang stehen und schwenken Sie sie häufig.
3. Legen Sie die Mischung für 30 Minuten in ein Eisbad und verwenden Sie sie dann sofort.

1. Wiegen Sie die Proben, die etwa 20 mg Protein entsprechen, in 25 x 150 mm große Röhrchen (auf das nächste mg genau gerundet) ein.
2. Stellen Sie die Proben 30 Minuten lang in ein Eisbad.
3. Geben Sie 10 mL kalte Perameisensäure zu den Proben, schwenken Sie sie vorsichtig und verschließen Sie sie mit einem mit Teflon beschichteten Kappe.
4. Lagern Sie die Proben (immer noch in reichlich Eis) bei 0 °C über Nacht (16 Stunden) im Kühlschrank.
5. Geben Sie nach 16 Stunden, während die Temperatur der Proben noch bei 0 °C liegt, 3 Tropfen Octanol und dann 3 mL gekühltes 48%iges HBr hinzu und schwenken Sie die Proben langsam. Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug durch. Lassen Sie die Proben 30 Minuten bei 0 °C stehen.
6. Dampfen Sie mit einem Vakuumverdampfer bei 37 °C bis zur Trockenheit ein. Dies wird 1 bis 2 Stunden dauern.
7. Fügen Sie 5 mL 6 N HCI zu den Röhrchen hinzu. Spülen Sie 30 Sekunden lang mit Stickstoff und verschließen Sie die Röhrchen dann sofort.
8. Legen Sie die Proben für 24 Stunden bei 110 °C in einen Ofen.
9. Nehmen Sie sie aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen.
10. Fügen Sie 10 mL des internen Standards, 5,0 µmol/mL, hinzu und mischen Sie gründlich. Hinweis: Die tatsächliche Konzentration des verwendeten internen Standards sollte so berechnet werden, dass sich bei der Injektion in das Gerät die gleiche Menge ergibt.
11. Übertragen Sie die Proben quantitativ in 250-mL-Messkolben, spülen Sie die Probenröhrchen mit Wasser in HPLC-Qualität und füllen Sie die Kolben zur Markierung mit der Spülung.
12. Filtrieren Sie ca. 1 mL der Proben aus Schritt 12 durch einen 0,45-µm-Probenfilter. Wenn die Derivatisierung nicht unmittelbar folgt, lagern Sie die verschlossenen Proben in einem Gefrierschrank. Hinweis: Diese Filtration kann durch eine Zentrifugation ersetzt werden. Zentrifugieren Sie, um einen klaren Überstand zu erhalten.

Tryptophan (Trp) ist unter den Standardbedingungen der Säurehydrolyse instabil und kann nicht effektiv analysiert werden. Als alternative Methode zur Freisetzung und Analyse dieser Aminosäure in Futtermitteln wird die Basenhydrolyse vorgeschlagen. Diese Methode verwendet 4,2 M NaOH, um das Protein zu hydrolysieren. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass nach Abschluss kein Derivatisierungsschritt erforderlich ist. Es ist lediglich eine Analyse mittels UV-Detektion bei 280 nm erforderlich.

Das hier vorgestellte Verfahren ist der AOAC Methode 988.15 Tryptophan in Foods and Food and Feed Ingredients entnommen.

• Modifizierte Mikro-Kjeldahl-Kolben (erhältlich von Ace Glass, Inc.) – 25-mL-Mikro-Kjeldahl-Kolben mit 12 mm Innendurchmesser und 15 cm langem Hals. Der Hals verengt sich auf etwa 6 mm Innendurchmesser, 5 cm über dem Kolben.
• Vakuumpumpe
• Membranfiltergerät und Filter von 0,45 µm
• Trockeneis
• Wasserbad
• Ethanol für das Wasserbad
• Vollpipetten und Glasgeräte
• pH-Messgerät

• Wasser, gereinigt mit dem Milli-Q System (Millipore Corp.) oder gleichwertige
• 4,2 M NaOH
• 1-Octanol
• Natriumcitrat-Pufferlösung, pH 4,25
• HCl
• Tryptophan-Standardlösung
  • Stammlösung – 1 mg/mL. Lösen Sie 250 mg L-Tryptophan in 100 mL H₂O mit sechs Tropfen HCl. Verdünnen Sie mit H₂O auf 250 mL.
  • Arbeitslösung I – 0,1 mg/mL. Verdünnen Sie 10 mL der Stammlösung mit H₂O auf 100 mL.
  • Arbeitslösung II – 0,04 mg/mL. Verdünnen Sie 4 mL der Stammlösung mit H₂O auf 100 mL.
  • Standardlösungen bei Nichtgebrauch kühl stellen. Stellen Sie monatlich frische Lösungen her.

1. Mahlen Sie die Laborprobe in einer Zentrifugalmühle mit einem 1-mm-Sieb; mischen Sie sie gründlich.
2. Wiegen Sie eine Testportion, die 100 mg Protein enthält, in einen modifizierten Mikro-Kjeldahl-Kolben ein.
3. Für Testproben mit > 5 % Lipiden:
   1. Geben Sie zur abgewogenen Testmenge im Kolben 10 mL Petrolether.
   2. Schwenken Sie sie vorsichtig, um sie zu mischen und ultrabeschallen Sie sie 20 Minuten lang. Lassen Sie sie absetzen. Zentrifugieren Sie sie gegebenenfalls.
   3. Saugen Sie so viel Petrolether wie möglich ab und achten Sie dabei darauf, keine Feststoffe zu entfernen.
   4. Verdampfen Sie den verbleibenden Petrolether unter einem sanften Strahl von N₂. Fahren Sie mit der Hydrolyse fort.
4. Für Testproben mit < 5 % Lipiden: Fahren Sie mit der Hydrolyse fort.

1. Entlüften Sie 4,2 M NaOH, indem Sie 10 Minuten lang N₂ durchleiten.
2. Geben Sie 10 mL entlüftetes 4,2 M NaOH in jeden Kolben.
3. Fügen Sie drei Tropfen 1-Octanol hinzu.
4. Frieren Sie die behandelte Lösung sofort in einem Bad aus Trockeneis und Ethylalkohol ein. Nehmen Sie dann den Kolben aus dem Bad und evakuieren Sie auf 10 mm.
5. Schalten Sie das Vakuum aus und verschließen Sie die Kolben.
6. Stellen Sie den verschlossenen Kolben in ein Becherglas mit H₂O bei Raumtemperatur, bis die Testlösung schmilzt.
7. Stellen Sie den Kolben für 20 Stunden bei 110 °C in einen Ofen.
8. Lassen Sie die Kolben auf Raumtemperatur abkühlen.
9. Spülen Sie den Kolbenhals mit 1 mL einer Natriumcitrat-Pufferlösung mit pH 4,25 und sammeln Sie die Flüssigkeit in einem Becherglas.
10. Übertragen Sie das Hydrolysat quantitativ in dasselbe 50-mL-Becherglas und spülen Sie den Kolben mit zwei Portionen Natriumcitrat-Pufferlösung mit pH 4,25.
11. Neutralisieren Sie die Lösung mit 3,5 mL HCl und rühren Sie kräftig um. Passen Sie den pH-Wert auf 4,25 ± 0,05 an.
12. Übertragen Sie die Lösung quantitativ in einen 25-mL-Messkolben und verdünnen Sie sie mit H₂O.
13. Gießen Sie die Lösung in ein 40-mL-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 20 Minuten lang bei 1150 G.
14. Filtrieren Sie den Überstand durch ein Glasfilterpapier (Whatman GF/A).
15. Übertragen Sie das Filtrat in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 23,000 G.

Hinweis: An diesem Punkt können Sie einen Aliquot des Überstands zur UV-Analyse (289 nm) ohne Derivatisierung entnehmen.