Umfassender Leitfaden zur Hydrolyse und Analyse von Aminosäuren

Die genaue Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Aminosäuren in der Forschung, Entwicklung und Vermarktung von Lebensmitteln, Futtermitteln und biotherapeutischen Produkten ist eine Herausforderung. Allen diesen Applikationen gemeinsam ist die Notwendigkeit einer adäquaten Probenhydrolyse, ein wichtiger erster Schritt im Arbeitsablauf bei der Analyse von gebundenen Aminosäuren, wie Peptiden und Proteinen. Die Hydrolyse ermöglicht die Analyse der freigesetzten Aminosäuren, die entweder mit Methoden der Ionenaustausch- oder Umkehrphasen-Chromatographie getrennt werden können.

Angesichts der Herausforderungen bei der Probenvorbereitung wurde dieses Dokument zusammengestellt, um nützliche Richtlinien für die Probenhydrolyse bereitzustellen. Das in diesem Dokument enthaltene Material dient lediglich als Ausgangspunkt für diesen Prozess. Je nach Probentyp und -komplexität können Modifikationen der beschriebenen Hydrolysemethoden erforderlich sein. Für weitere Informationen oder Tipps zur Fehlerbehebung bei der Hydrolyse oder einem spezifischen Verfahren wenden Sie sich bitte an den Hersteller Ihres Hydrolysegeräts oder an die zuständige Behörde – Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Waters kann keine Empfehlungen zu spezifischen Probentypen geben.

Zur Analyse der hydrolysierten Proben (freigesetzten Aminosäuren) mittels HPLC oder UPLC bietet Waters viele Lösungen an, die eine Vorsäulenderivatisierung verwenden, sodass Aminosäuren durch optische Detektion analysiert werden können. Da dies ein integraler Bestandteil des Arbeitsablaufs ist, fügen wir eine kurze Einführung in die HPLC-Methode (AccQ•Tag) und die UPLC-Aminosäureanalyse-Lösung (AccQ•Tag Ultra) hinzu. Dieses Dokument enthält keine Informationen in Bezug auf die Aminosäureanalysemethode Pico-Tag (Phenylisothiocyanat-Vorsäulenderivatisierungsreagenz) von Waters. Obwohl die Pico-Tag Methode noch verfügbar ist, bieten AccQ•Tag basierte Methoden erhebliche Leistungsvorteile und werden für neue Applikationen empfohlen.

Hinweis: Dieses Dokument befasst sich mit der Hydrolyse und Aminosäureanalyse aus gereinigten Proteinen/Peptiden, Lebensmitteln und Futtermitteln. Sie ist nicht speziell für die Analyse von Aminosäuren in Proben von Urin, Plasma, TPE-Produkten oder Zellkulturmedien bestimmt. Informationen zu diesen Applikationen finden Sie auf www.waters.com/AAA und www.waters.com/Kairos.

Allgemeine Richtlinien und Empfehlungen zur Analyse

Da Aminosäuren in der Umwelt allgegenwärtig sind, kann eine Hintergrundkontamination leicht 20 pmol oder mehr einiger Aminosäuren zur gewünschten Probenanalyse beitragen, insbesondere bei Serin (Ser) und Glycin (Gly). Die Menge kann durch besondere Vorsichtsmaßnahmen reduziert werden. Wenn eine ausreichende Menge der Probe hydrolysiert wird, um ein Minimum von 200 pmol pro Aminosäure zu erhalten, kann der Beitrag der Hintergrundkontamination auf weniger als 10 % begrenzt werden. Um die Empfindlichkeit moderner Derivatisierungstechniken und chromatographischer Systeme, die Nachweisgrenzen von 1 pmol oder weniger haben können, zu nutzen, sind Sauberkeit und gute Labortechniken entscheidend. Kontaminationsquellen gibt es überall. Schmutzige Glasgeräte, Labortiere, Staub in der Luft, Fingerabdrücke und Talkumpuder sind häufig die Ursachen.

Auch wenn es kein perfektes System zur Verbesserung der Gesamtqualität von Analysen mit niedrigen Aminosäuremengen gibt, helfen die folgenden Überlegungen und Vorgehensweisen:

• Pyrolysieren Sie alle 6 x 50-mm-Hydrolyseröhrchen (Ersatzteilnummer: WAT007571) über Nacht bei 500 °C, um ein höchstmöglich sauberes Glas zu erhalten. Nachdem Sie die Röhrchen aus dem abgekühlten Ofen genommen haben, decken Sie sie mit Aluminiumfolie (mit Aceton gereinigt) ab und bewahren sie an einem abgedeckten Bereich auf.
• Achten Sie auf die mögliche Kontamination durch Pipetten, Einwegspitzen, Spritzen und anderes Zubehör, das bei dem Verfahren verwendet wird.
• Führen Sie vor der Hydrolyse alle Arbeitsschritte mit sauberen, puderfreien Handschuhen und sauberen Pinzetten durch. Es kann sinnvoll sein, eine chirurgische Maske zu tragen.
• Verwenden Sie stets frische Reagenzien. Jedes Reagenz kann eine Kontaminationsquelle darstellen. Am besten ist es, frisch geöffnete Flaschen in kleinere, saubere Behälter aufzuteilen.
• Prüfen Sie die Qualität der Reagenzien wöchentlich mit Kontroll-Derivatisierungen von Blindproben.
• Wenden Sie möglichst immer das Verfahren der Dampfphasenhydrolyse an. Unreines HCl kann die Ursache für eine unzuverlässige Hydrolyse sein. Unsere beständigsten Ergebnisse haben wir mit konstant siedender HCl erzielt. Hochreine, analysenreine, konzentrierte HCI ist wahrscheinlich nicht so sauber und enthält deutlich mehr Chlor als die konstant siedende Qualität.
• Testen Sie Wasser und Pufferbestandteile als Kontrollproben auf etwaige Hintergrundkontamination. Doppelt destilliertes Wasser aus dem Labor enthält zum Beispiel oft inakzeptable Mengen an Aminosäuren. Für die beste Wasserqualität empfehlen wir dringend ein Reinigungssystem (18,2-mΩ-cm-Wasser).
• Eine geeignete Kontroll-Blindprobe für die Hydrolyse ist ein Probenröhrchen, das genau so behandelt wurde wie die Probe. Dies beinhaltet den Hydrolyseschritt.