Umfassender Leitfaden zur Hydrolyse und Analyse von Aminosäuren

Wie bereits erwähnt, gibt es verschiedene Geräte, die speziell die Hydrolyse von Proben unterstützen. Unabhängig vom Gerät gibt es normalerweise drei verschiedene Hydrolyseprotokolle: die saure Hydrolyse, die zur Bestimmung der Zusammensetzung des Gesamtproteins verwendet wird; die saure Hydrolyse nach der Oxidation mit Perameisensäure, die erforderlich ist, um schwefelhaltige Aminosäuren wie Cystein und Methionin zu messen; und die alkalische Hydrolyse zur Beurteilung der Wiederfindung von Tryptophan. Während herkömmliche Geräte zur Probenhydrolyse oft mit einem zeitaufwendigen Prozess einhergehen, kann dies mit Geräten für die Mikrowellenhydrolyse erheblich beschleunigt werden. Die Implementierung der Mikrowellenhydrolyse für alle drei Protokolle führt zu einer besseren Kontrolle der Hydrolysebedingungen mit besserer Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Geschwindigkeit und Robustheit.

Mithilfe der Mikrowellentechnologie kann das CEM Discover SP Microwave Reaction System (CEM Corporation 3100 Smith Farm Road Matthews, NC 28104) (Abbildung 7) Proteine und Peptide in Vorbereitung auf die Aminosäureanalyse in nur 15 Minuten hydrolysieren. Wie in Abbildung 8 dargestellt, ermöglicht die direkte Anwendung von Mikrowellenenergie und die Verwendung integrierter IR-Temperatursensoren ein schnelles Aufheizen und Halten der eingestellten Temperatur bei jeder Probe. Das In-situ-Rühren gewährleistet eine gleichmäßige Wärmeverteilung in der Probe, und durch das Abschrecken nach der Reaktion wird die Probe in Sekundenschnelle abgekühlt.

Im folgenden Abschnitt werden die Einrichtung und der Betrieb des Systems beschrieben. Für weitere Informationen wenden Sie sich an die CEM Corporation oder lesen im Systemhandbuch nach.

• Das System hat einen Strombedarf von 110 bis 140 VAC, 60 Hz, 10 A bei 120 VAC.
• Das System muss entlüftet werden.
• Für das System sind mindestens 25 psi und maximal 60 psi Druckluft oder komprimierter Stickstoff erforderlich.
• Für das System ist ein Laptop (von CEM bereitgestellt) notwendig, der sich in einem Abstand von maximal drei Metern (zehn Fuß) zum System befindet.

• 6 N HCl für die saure Hydrolyse, 1:1 konzentriertes HCl:DI-Wasser
• 4 N NaOH für die basische Hydrolyse, 16 g festes NaOH in 100 mL entionisiertem Wasser auflösen
• Perameisensäure (nur Präoxidation), 9:1 Ameisensäure:30 % Wasserstoffperoxid
• 10- oder 35-mL-Vial für Discover SP mit Rührstab und Deckel
• Phenolkristalle

Option 1

1. Wiegen Sie 50 bis 500 mg der Probe in ein 35-mL-Vial mit Rührstab ab.
2. Legen Sie die Aufschlussröhrchen etwa 15 Minuten lang in ein Eisbad.
3. Fügen Sie nach dem Abkühlen 5 mL Perameisensäure hinzu.
4. Decken Sie die Röhrchen mit Glasstopfen ab und rühren Sie 15 Minuten lang auf einer Magnetrührplatte bei niedriger Geschwindigkeit.
5. Stellen Sie die Aufschlussröhrchen wieder in das Eisbad und lassen Sie sie 16 Stunden lang oxidieren.
6. Entfernen Sie die Glasstopfen und fügen Sie 0,84 g Natriummetabisulfit hinzu, um die Perameisensäure zu zersetzen.
7. Führen Sie die saure Hydrolyse durch, beginnend mit Schritt 2 von Option 1 in Abschnitt 5.4.2 Saure Hydrolyse.

Option 2

1. Wiegen Sie 50 bis 500 mg der Probe in ein 35-mL-Vial mit Rührstab ab.
2. Fügen Sie 6 mL frisch zubereitete Perameisensäure (9:1 Ameisensäure:30 % Wasserstoffperoxid) hinzu.
3. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 50 °C.
4. Dampfen Sie die restliche Perameisensäure in einem Verdampfer bei 50 °C bis zur Trockenheit ein.
5. Führen Sie die saure Hydrolyse durch, beginnend mit Schritt 2 von Option 1 in Abschnitt 5.4.2 Saure Hydrolyse.

Option 1: 50 bis 300 mg Probe

1. Wiegen Sie die Probe in ein 35-mL-Vial mit Rührstab ab.
2. Fügen Sie 3 Gew.-% Phenol hinzu.
3. Geben Sie 5 mL 6 N HCl hinzu.
4. Setzen Sie die Verschlusskappe auf das Vial.
5. Programmieren Sie mithilfe der Dynamic Method Control eine Methode mit 300 W, 15 Minuten Halten, 195 °C und 300 psi. Die Rührfunktion sollte auf hoch eingestellt sein.
6. Stellen Sie das Vial in die Discover-Kavität und drücken Sie die Taste Start, um die Methode zu starten.
7. Die Probe sollte sich bei höchstens 250 psi (±10 %) auf 195 °C erwärmen.

Option 2: 300 bis 500 mg Probe

1. Wiegen Sie die Probe in ein 35-mL-Vial mit Rührstab ab.
2. Fügen Sie 3 Gew.-% Phenol hinzu.
3. Geben Sie 10 mL 6 N HCl hinzu.
4. Setzen Sie die Verschlusskappe auf das Vial.
5. Programmieren Sie mithilfe der Dynamic Method Control eine Methode mit 300 W, 15 Minuten Halten, 195 °C und 300 psi. Die Rührfunktion sollte auf hoch eingestellt sein.
6. Stellen Sie das Vial in die Discover-Kavität und drücken Sie die Taste Start, um die Methode zu starten.
7. Die Probe sollte sich bei höchstens 250 psi (±10 %) auf 195 °C erwärmen.

Option 1: 50 bis 300 mg Probe

1. Wiegen Sie die Probe in ein 35-mL-Vial mit Rührstab ab.
2. Geben Sie 5 mL 4 N NaOH hinzu.
3. Setzen Sie die Verschlusskappe auf das Vial.
4. Programmieren Sie mithilfe der Dynamic Method Control eine Methode mit 300 W, 15 Minuten Halten, 195 °C und 300 psi. Die Rührfunktion sollte auf hoch eingestellt sein.
5. Stellen Sie das Vial in die Discover-Kavität und drücken Sie die Taste Start, um die Methode zu starten.
6. Die Probe sollte sich bei höchstens 250 psi (±10 %) auf 195 °C erwärmen.

Option 2: 300 bis 500 mg Probe

1. Wiegen Sie die Probe in ein 35-mL-Vial mit Rührstab ab.
2. Geben Sie 10 mL 4 N NaOH hinzu.
3. Setzen Sie die Verschlusskappe auf das Vial.
4. Programmieren Sie mithilfe der Dynamic Method Control eine Methode mit 300 W, 15 Minuten Halten, 195 °C und 300 psi. Die Rührfunktion sollte auf hoch eingestellt sein.
5. Stellen Sie das Vial in die Discover-Kavität und drücken Sie die Taste Start, um die Methode zu starten.
6. Die Probe sollte sich bei höchstens 250 psi (±10 %) auf 195 °C erwärmen.

Die Temperatur-, Zeit- und Leistungseinstellungen hängen von der Art der zu hydrolysierenden Proben ab. Es ist wichtig, dass die Mikrowelle während des gesamten Vorgangs funktionsfähig bleibt. Dies kann erfordern, dass der Benutzer etwas experimentiert, um seine Proben mithilfe dieser Technik zu optimieren.

Es wird empfohlen, bei den zuvor beschriebenen Verfahren die richtige Probengröße, das richtige Volumen und die richtigen Gefäße zu verwenden. Diese Faktoren sind entscheidend für den Erfolg der Hydrolyse. Einige Komponenten der Probe bleiben nach der Hydrolyse in der festen Phase und werden während des Vorgangs normalerweise schwarz, wie in Abbildung 9 gezeigt. Dieser Vorgang ist normal; die Aminosäuren liegen in Lösung. Bitte richten Sie alle Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung von CEM-Geräten an die CEM Corporation per E-Mail an molecular.support@cem.com oder wählen Sie die Nummer 1-704-821-7015 und fragen Sie nach dem CEM Molecular Sample Preparation Team.