Guide technique de la chromatographie en phase liquide préparative

Bien que les séparations complexes soient principalement affectées par la sélectivité du matériau de garnissage de la colonne, il est plus efficace, lors du développement d'une méthode de séparation ciblée sur la purification, de commencer par optimiser la séparation des échantillons générée par un gradient de référence rapide. L'objectif des gradients de référence est de déterminer la concentration approximative de solvant nécessaire pour éluer le ou les composés d'intérêt de la colonne. Les gradients de référence partent généralement de la même concentration en solvant fort (2-10 %) et augmentent de façon linéaire jusqu'à 25, 75, 50 et 90-95 %.

Une fois les gradients de référence terminés, les résultats sont examinés et évalués par une série de questions avant de passer à l'étape suivante :

• Le gradient de référence rapide assure-t-il une séparation adéquate du composé d'intérêt ?
• Le gradient de référence rapide est-il approprié à la vitesse ou à l'efficacité ?
• La séparation du composé d'intérêt des autres pics peut-elle être maintenue à la charge d'échantillon requise ?

Si le gradient de référence ne donne pas un résultat adéquat, il peut être optimisé par le ciblage de la méthode, ou bien la séparation peut être entièrement modifiée par le biais du pH, du solvant ou d'autres variables chromatographiques.

Optimisation de la méthode

L'analyse de référence offrant la meilleure résolution pour le composé d'intérêt peut être optimisée en modifiant la composition des solvants forts et des solvants faibles. La composition peut rester constante (isocratique) ou varier en fonction d'une unité de temps ou d'un volume de colonne donnés (gradient).

Élution isocratique

Dans une séparation isocratique, le solvant faible et le solvant fort sont maintenus dans un rapport constant par unité de temps. Le solvant isocratique peut être préparé hors ligne par le scientifique ou mélangé en ligne avec une pompe HPLC capable de doser les différents solvants à un taux constant et prédéfini. Ce mode d'élution est pratique, constant et robuste, car l'influence du temps de rétention dû au volume mort est négligeable lors du transfert d'une méthode entre systèmes.

L'élution isocratique présente des inconvénients et peut ne pas être adaptée à toutes les séparations. Il existe des problèmes inhérents, notamment une mauvaise résolution des pics à élution précoce, une diminution de la symétrie due à la traînée des pics, une diminution de la sensibilité due à l'élargissement des bandes et des problèmes de contamination de la colonne dus à l'accumulation de composés fortement retenus.

Élution par gradient

Les séparations par gradient en phase inverse ou par échange d'ions impliquent généralement un mélange en ligne de la phase mobile pour obtenir une augmentation constante du solvant organique tout au long de l'analyse. Au début du gradient, lorsque la force du solvant est faible, l'analyte est réparti dans la phase stationnaire ou reste en tête de colonne. À mesure que la force du solvant augmente, l'analyte est transféré dans la phase mobile, se déplace le long de la colonne et est finalement élué.

L'élution par gradient permet de séparer des analytes avec une large plage d'hydrophobie dans un temps raisonnable. Les avantages supplémentaires peuvent inclure une résolution de pic améliorée et une sensibilité accrue du fait d'une hauteur de pic plus importante. La détérioration de la colonne est également minimisée lorsque les composants fortement retenus sont lavés de la colonne à la fin de l'analyse.

L'élution par gradient présente également des inconvénients. Un mélange par gradient en ligne constant et sans pulsations est nécessaire. Une instrumentation de pompage onéreuse est donc souvent nécessaire. De plus, une précipitation peut se produire lorsque certaines phases mobiles sont mélangées selon certaines combinaisons. Les temps d'analyse peuvent être longs en raison du rééquilibrage postgradient, et le temps de cycle (Vd) peut varier selon les instruments, entraînant des problèmes de transfert de méthode, sans compensation adéquate.

Gradient linéaire

Les gradients linéaires progressent avec une augmentation constante de la composition du solvant fort tout au long de l'analyse. Ils sont souvent utilisés dans les expériences d'exploration rapide pour déterminer rapidement le rapport de solvant qui élue le pic d'intérêt et garder une durée d'analyse raisonnablement courte, ce qui permet une élution plus rapide et des coûts de solvant réduits.

Gradient segmenté

Un gradient segmenté est une combinaison d'une série de gradients linéaires, chacun présentant une courbe ou une pente différente. Les segments à pente douce résolvent les composés d'intérêt, tandis que les segments à pente forte sont des zones du chromatogramme où une résolution élevée n'est pas requise, comme dans un lavage après séparation.

Les gradients ciblés sont généralement plus courts et plus amplifiés que les gradients segmentés. En général, immédiatement après l'injection, la force du solvant est très faible. Elle est ensuite rapidement augmentée jusqu'à ce qu'elle soit comprise entre 2 et 5 % en dessous du rapport de solvant requis pour l'élution du composé d'intérêt (c'est-à-dire une concentration d'élution de 22 % – 2 % = 20 % du gradient de pente douce de départ). Un gradient de pente douce se poursuit ensuite à environ 1/5 de la pente déterminée dans la séparation de référence rapide pour se terminer finalement entre 2 et 5 % au-dessus de la concentration d'élution pour le composé d'intérêt (c'est-à-dire 22 % + 2 % = 24 % du gradient de pente douce d'arrêt). Enfin, le pourcentage de solvant est rapidement augmenté pour éliminer de la colonne tout composé de l'échantillon restant.

Développement d’un gradient ciblé

Les calculs suivants peuvent être utilisés pour générer un gradient ciblé pour le composé d'intérêt après l'analyse de l'échantillon avec un gradient de référence rapide. Chaque équation est suivie d'un exemple théorique.

Il faut tout d'abord déterminer le volume mort du système pour l'instrument utilisé lors de l'analyse du gradient de référence. Des instructions pour la détermination du volume mort sont disponibles dans la section du présent guide technique intitulée « Détermination du volume mort » ou dans l'outil applicatif « Analytical to Prep Gradient Calculator » (Calculateur de gradient analytique à préparatif) sur www.waters.com/prepcalculator.

En outre, il faut également déterminer le volume de la colonne utilisée pour l'analyse de référence. Il peut être calculé en utilisant le volume d'un cylindre V = πr²h et en compensant le volume occupé par le matériau de conditionnement c'est-à-dire V = r²h (66 %). L'outil applicatif « Analytical to Prep Gradient Calculator » (Calculateur de gradient analytique à préparatif) peut également être utilisé pour effectuer ce calcul.

Équation 1 : volume de la colonne

Volume de la colonne = π r² x hauteur x 66 % disponible pour la phase mobile/1 000 pour convertir les mm³ en mL

Exemple :

VC = 3,14 x (4,6 mm/2)² x 50 mm x 0,66/1000 VC = 548 mm³ = 0,548 mL

Équation 2 : volume de décalage entre la formation du gradient et le détecteur

Volume de décalage = volume du système* + volume de la colonne
*Volume du système ou volume mort

Exemple :

Volume de décalage = 1,04 mL + 0,548 mL
Volume de décalage = 1,588 mL

Équation 3 : temps jusqu’au détecteur

Temps jusqu’au détecteur = décalage en mL/débit en mL/min

Exemple :

Temps jusqu’au détecteur = 1,588 mL/1,5 mL/min
Temps jusqu’au détecteur = 1,06 min

Équation 4 : temps de formation de la concentration d’élution

Temps de la concentration d’élution = Temps de rétention du pic d’intérêt – Temps jusqu’au détecteur – Maintien du gradient

Exemple :

Temps de la concentration d’élution = 6,0 min – 1,06 min – 0,0 min Temps de la concentration d’élution = 4,94 min

Équation 5 : concentration d’élution en pourcentage

Concentration d’élution en pourcentage = temps de la concentration d’élution/durée du segment de gradient de référence x changement de référence + pourcentage du gradient de référence initial

Exemple :

Concentration d’élution en pourcentage = 4,94 min/6,0 min x 90 % + 5 %
Concentration d’élution en pourcentage = 79,1 %

Équation 6 : nombre de volumes de colonne (VC)

Nombre de volumes de colonne = 1 volume de colonne/mL × débit mL/min × durée du segment de gradient de référence

Exemple :

Nombre de VC = 1 VC/0,548 mL x 1,5 mL/min x 6 min
Nombre de VC = 16,4

Équation 7 : pente du gradient de référence

Pente du gradient de reconnaissance = pourcentage de variation du gradient de référence/nombre de volumes de colonne

Exemple :

Pente du gradient de référence = (95 % – 5 %)/16,4 VC
Pente du gradient de référence = 5,49 %/VC

Équation 8 : pente du gradient ciblé

Pente du gradient ciblé = 1/5 x pente du gradient de référence

Exemple :

Pente du gradient ciblé = 1/5 x 5,49 %/VC Pente du gradient ciblé = 1,1 %/VC

Le segment de gradient ciblé est créé entre 5 % en dessous et 3 à 5 % au-dessus du pourcentage d'élution estimé. À titre d'exemple, le pourcentage d'élution est de 79 %.

Équation 9 : durée du segment de gradient ciblé

Durée du segment de gradient ciblé = plage en % x (1/pente du gradient de référence) x volume de colonne x (1/débit)

Exemple :

Durée du segment de gradient ciblé = (79 % + 5 %) - (79 % - 5 %) x (1/1,1 %) x (0,548 mL) x (1/1,5 mL/min) Durée du segment de gradient ciblé = 3,32 min

La dernière étape consiste à écrire le gradient ciblé en utilisant les valeurs calculées dans les formules précédentes.