Guide technique de la chromatographie en phase liquide préparative

La chromatographie est définie comme la séparation d'un mélange sur la base des attributs chimiques des composés de ce mélange. La chromatographie préparative (Prep), ou chromatographie de purification, est définie comme le procédé consistant à utiliser la chromatographie pour isoler un composé en quantité et à un niveau de pureté suffisants pour permettre la réalisation d'expériences ou de procédés ultérieurs. Un scientifique détermine un composé d'intérêt, puis développe une méthode pour réussir à séparer et à isoler ce composé des matériaux de départ, des réactions secondaires ou d'autres impuretés. L'objectif global est de répondre aux besoins croissants de productivité et de rendement élevés, tout en adaptant les techniques de purification pour répondre aux conditions d'échelle, de pureté et de reproductibilité requises.

La chromatographie de purification est utilisée dans de nombreux contextes scientifiques, des grandes entreprises pharmaceutiques aux petits groupes de recherche sur les produits naturels. Bien que les domaines d'application puissent différer, les exigences générales d'utilisation sont assez similaires, avec un niveau de pureté final souhaité de 95 % ou plus pour l'isolement de la cible.

Le but de ce guide technique est de fournir aux chromatographistes en phase liquide des informations préliminaires concernant le domaine en pleine expansion qu'est la purification par LC. Les principes fondamentaux y sont présentés, tels que le développement d'une méthode de séparation chromatographique, les équations mathématiques nécessaires à la mise à l'échelle de la méthode et les modes de collecte de fractions couramment utilisés. La phase inverse est le principal mode de séparation abordé, car elle est utilisée dans la plupart des applications de LC préparative.

Le succès d'un isolement par purification est déterminé par la vitesse d'analyse, le rendement et la pureté de l'isolat obtenu. L'isolement dépend de la séparation ou la « résolution » des pics. Les paramètres chromatographiques suivants sont ceux ayant l'impact le plus significatif sur la résolution :

• Le matériau de la garniture de la colonne (phase stationnaire)
• La force du solvant

Les conditions permettant d'obtenir une résolution optimale sont déterminées par l'exécution d'une procédure de développement de méthode. La procédure est assez simple, mais comporte de multiples étapes, dont la complexité et la nécessité dépendent des propriétés uniques de chaque échantillon. Quel que soit l'application ou le mode de séparation des échantillons (c'est-à-dire en phase inverse, par échange d'ions, etc.), la procédure sera généralement la même.

Le facteur le plus important à prendre en compte avant de concevoir une procédure est la nature du composé cible. En cas d'isolement d'un composé connu à partir de la même source ou d'une nouvelle source, il est facile d'obtenir des informations bibliographiques sur le comportement chromatographique du composé cible, et la méthode d'isolement appropriée peut être choisie sans grande difficulté parmi les méthodes précédemment publiées. Cependant, il est plus difficile de concevoir un protocole d'isolement pour un extrait brut dont les types de composés sont inconnus. Dans ce cas, une série d'expériences exploratoires peut être réalisée après l'isolement initial pour en savoir plus sur le composé d'intérêt telles que le pK_a, la masse moléculaire, la solubilité, la stabilité, les spectres UV et l'activité biologique. À partir de ces informations, la méthode de séparation initiale peut être modifiée pour répondre aux conditions chimiques et physiques requises par le composé. Non seulement ces informations sont utiles dans le développement de méthodes, mais elles sont également utiles après la collecte, lorsque la stabilité du produit isolé devient importante.

La première étape consiste à préparer un échantillon et à effectuer une séparation générale à l'aide d'un gradient de référence rapide. Cette opération est généralement réalisée à petite échelle pour conserver une quantité précieuse d'échantillon. À partir de cette séparation, les conditions du solvant qui élue le composé d'intérêt peuvent être calculées et les conditions de séparation optimisées davantage pour obtenir une résolution maximale. Une étude de chargement peut également être effectuée pour déterminer la quantité d'échantillon pouvant être chargée tout en maintenant une résolution suffisante pour produire un isolat d'un degré de pureté élevé.

Une fois que la méthode de séparation et la charge d'échantillon souhaitée ont été établies, une mise à l'échelle de la méthode est souvent effectuée, bien que non systématiquement, pour les isolats prometteurs ou ayant une valeur potentielle. Le terme « mise à l'échelle » dans le présent guide technique est destiné à décrire les instruments et la méthodologie nécessaires pour atteindre les objectifs de pureté, de vitesse d'analyse et de rendement de l'application. Lorsqu'une méthode est « mise à l'échelle », elle est déplacée vers un système doté d'un matériel adapté à la prise en charge de chargements d'échantillons plus importants. La mise à l'échelle implique essentiellement de passer d'une colonne de diamètre analytique à une colonne de diamètre préparatif tout en conservant la résolution par une série de calculs de mise à l'échelle et des changements de matériel.

Échantillons

Les échantillons à partir desquels un composé particulier peut être isolé proviennent d'un large éventail de sources, notamment d'intermédiaires médicamenteux, de produits naturels, de nutraceutiques, de boissons ou de produits industriels. Tant qu'un matériau peut être extrait et dissous dans une matrice liquide, les composés individuels peuvent être purifiés par chromatographie.

Les techniques utilisées pour l'extraction de l'échantillon dépendent de la complexité du matériau dont il est extrait. Pour les produits naturels, l'échantillon est généralement séché et broyé en fines particules pour augmenter l'efficacité de l'extraction. Ensuite, une technique peut être utilisée pour extraire les composés d’intérêt, telle que la percolation pour les échantillons de grande taille, ou la macération pour les échantillons de petite taille. Les deux techniques impliquent l'ajout d'un solvant à l'échantillon et la collecte du soluté après sonication, agitation ou trempage. Une fois l'extrait recueilli, comme pour tous les échantillons HPLC, il doit être filtré pour éliminer les particules et les bulles avant l'injection.

Modes de séparation

Il existe quatre principaux modes de séparation utilisés en chromatographie préparative. Ceux-ci incluent la phase inverse, la phase normale, la perméation de gel et l'échange d'ions. Le mode de séparation adapté est déterminé par la compatibilité de la phase stationnaire et des solvants avec l'échantillon, l'extrait ou le mélange analysé.

La phase inverse, la technique la plus couramment utilisée pour le développement de la purification, utilise une phase stationnaire moins polaire que le solvant d'élution. L'éluant est un mélange d'eau et d'acétonitrile ou de méthanol, tandis que des tampons (acides ou bases) sont ajoutés pour contrôler le degré d'ionisation de l'échantillon et occuper les groupes silanols libres présents dans la phase stationnaire et n'ayant pas réagi. Les matériaux de phase greffée ou les sorbants dans les phases stationnaires à base de silice sont dérivés à l'aide de réactifs alkylsilyles afin de réduire la traînée de pic et d'améliorer la reproductibilité chromatographique. Le degré de charge en carbone de ces réactifs dérivés (silanisation) peut conférer aux colonnes faites par différents fabricants des caractéristiques de séparation uniques.

Développement d’une méthode de démarrage rapide

Pour établir une séparation en phase inverse, on choisit souvent une colonne analytique à petite échelle (diamètre ≤ 4,6 mm) avec une longueur et un matériau de conditionnement disponibles à grande échelle (diamètre ≥ 10 mm) pour faciliter une future mise à l'échelle. Il est essentiel de trouver le bon système de solvant pour obtenir une séparation optimale. Pour les composés acides, on prépare généralement une phase mobile aqueuse à un pH acide, tandis que le solvant fort préparé est du méthanol ou de l'acétonitrile. L'acide formique, dont la concentration est égale à 0,1 %, est un additif de tampon couramment utilisé, car il est compatible à la fois avec la détection UV et par spectrométrie de masse. La compatibilité MS est utile lors de l'identification de composés inconnus et de la préparation d'un isolat purifié en vue d'une étude complémentaire. Une phase mobile à pH basique peut être utilisée à la place d'un pH acide pour maintenir la forme non ionisée des molécules basiques. Avant d'utiliser un tampon, quel que soit son pH, la compatibilité doit être vérifiée sur la notice de la phase stationnaire de la colonne.

La phase mobile aqueuse est généralement placée en position de pompe A et le solvant fort en position de pompe B. « A » et « B » seront utilisés tout au long de ce guide technique pour désigner respectivement le solvant aqueux et le solvant fort dans les tableaux de la pompe.