Guide technique de la chromatographie en phase liquide préparative

L'injection de l'échantillon peut se faire manuellement pour une vitesse d'analyse faible, ou bien être automatique pour les applications à vitesse d'analyse élevée. En injection manuelle, une vanne Rheodyne équipée d'une boucle d'injection est retirée du circuit fluidique en tournant une manette de vanne. Un échantillon filtré est aspiré dans une seringue, une aiguille émoussée y est fixée et les bulles d'air sont éliminées. L'aiguille est insérée dans l'orifice d'injection de l'échantillon et l'échantillon est distribué dans la boucle d'injection. La manette de la vanne Rheodyne se tourne pour replacer la boucle d'injection dans le circuit fluidique. Dans cette position, l'échantillon est placé dans le circuit fluidique.

L'injection des échantillons peut également être automatique pour une vitesse d'analyse élevée. Les passeurs d'échantillons haute capacité peuvent gérer l'aspiration et l'injection des échantillons sur une seule plateforme. Un bras robotisé est configuré dans le logiciel de purification afin de piloter l'injection d'échantillons à partir de plaques de microtitration, de tubes à essai, de flacons à scintillation ou de flacons pour passeurs d'échantillons classiques.

Boucles d’injection

Une boucle d'injection est généralement choisie en fonction de la taille du volume d'injection prévu. Lorsque le volume de la boucle est trop important, l'échantillon peut être absorbé sur la surface en excès de la boucle, entraînant un retard ou une dispersion de l'échantillon, les deux pouvant avoir un effet négatif sur la qualité de la chromatographie. Une taille de boucle proche du volume d'injection prévu offre la meilleure reproductibilité et le meilleur profil chromatographique.

Collecteurs de fractions

La vitesse d'analyse souhaitée pour l'application détermine le niveau d'automatisation nécessaire à la collecte des fractions. Un collecteur de fractions est constitué d'un interrupteur et d'une vanne de dérivation d'échantillon. La vanne de dérivation est ouverte au moment opportun pour permettre la récupération des composés au fur et à mesure de leur élution.

Si la collecte des fractions peut être effectuée manuellement pour les applications à faible vitesse d'analyse, elle peut également être automatique une vitesse d'analyse plus élevée. Le niveau d'automatisation est déterminé par le nombre et le volume de fractions souhaités. Les collecteurs de fractions à débit élevé combinent souvent l'injection d'échantillon et la collecte de fractions sur le même plan de travail à l'aide d'un bras robotisé équipé de sondes de prélèvement et de collecte de fractions.

Récipients de collecte

De nombreux systèmes de purification peuvent s'adapter à une large gamme de formes, de tailles et de volumes de récipients de collecte. Les récipients de collecte les plus courants sont les tubes à essai, les flacons, les bouteilles ou les entonnoirs qui se distribuent dans de grands récipients. Les récipients de collecte doivent être propres, secs et inertes lorsqu'ils sont exposés à l'échantillon et au solvant. Ils sont généralement placés dans le lit de collecte du récipient sans fermeture supérieure pour permettre la distribution de l'isolat.

Avec certains systèmes de collecte, les fractions qui ne sont pas collectées ne sont pas éliminées, mais peuvent être placées dans un récipient à déchets spécifique à l'échantillon. Si l'utilisateur collecte le mauvais pic, exécute une méthode inappropriée, ne détecte pas la cible ou si la collecte ne se déclenche pas, elle s'écoulera dans un récipient à déchets spécial à partir duquel le solvant pourra être évaporé, et l'échantillon redissous et réinjecté.

Détecteurs

Une attention particulière doit être portée à la détection lors de la réalisation d'une chromatographie de purification. Les quatre principaux types de détecteurs utilisés pour la purification sont les détecteurs UV/Vis, les réfractomètres, les détecteurs évaporatifs à diffusion de lumière (ELS) et avec spectromètrie de masse (MS).

Les détecteurs peuvent détecter à une longueur d'onde unique pouvant être réglée par l'utilisateur (UV/Vis), ou l'absorbance sur une plage de longueurs d'onde peut être recueillie par un détecteur à barrette de diodes (PDA). Le détecteur PDA est souvent utilisé pendant le développement de méthodes pour sélectionner une longueur d'onde adaptée au composé d'intérêt. Cela se fait en collectant des longueurs d'onde comprises entre 200 et 400 nm ou plus (≥ 350 nm) pour le domaine visible. La longueur d'onde qui fournit l'intensité de signal maximale pour le composé d'intérêt est la longueur d'onde optimale pour l'isolement. La longueur d'onde optimale pour les impuretés à élution proche doit également être déterminée. Dans le cas contraire, un « isolat pur » recueilli à une longueur d'onde donnée peut en réalité contenir des impuretés lorsqu'il est observé à une longueur d'onde différente. Lorsque cela se produit, le développement d'une méthode secondaire et une purification peuvent s'avérer nécessaires pour purifier davantage l'isolat.

Lors de l'utilisation de détecteurs UV/Vis et PDA, une sensibilité élevée peut être un obstacle courant pendant la purification pour les volumes d'injection importants et les concentrations d'échantillon élevées. Par conséquent, on utilise des cellules de détection à trajet optique court (1 à 3 mm) plutôt que des cellules de détection analytiques à trajet optique long (10 mm).

Les détecteurs RI présentent certains avantages pour la détection de composés à absorption UV limitée, voire nulle, tels que les alcools, les sucres, les saccharides, les acides gras et les polymères. Le détecteur RI détecte les différences d'indice de réfraction pour déterminer la présence ou l'absence d'un composé. Le détecteur RI est parfois appelé détecteur « universel », car il ne dépend pas de la ionisation du composé ou de la présence d'un chromaphore. L'un des inconvénients du détecteur RI est qu'il ne peut être utilisé que pour des séparations isocratiques, afin d'éviter la détection de perturbations du gradient entraînant une dérive de la ligne de base.

Les détecteurs ELS peuvent être utilisés comme alternative aux détecteurs UV/Vis et à réfractomètres. Le fonctionnement des détecteurs ELS consiste à faire passer l'éluat dans un nébuliseur chauffé pour volatiliser l'analyte et évaporer le solvant. Le solvant est emporté sous forme de gaz, mais l'analyte forme un flux de fines particules, qui passe entre une source lumineuse et un détecteur qui diffuse la lumière et mesure l'effet. Les principaux avantages des détecteurs ELS sont qu'ils détectent les composés ne possédant pas de chromophore et qu'ils peuvent être utilisés à la fois pour des séparations isocratiques et des séparations par gradient. Un inconvénient est que les détecteurs ELS détruisent les échantillons. Par conséquent, le détecteur ne peut pas être aligné sur le circuit fluidique principal. Le circuit fluidique doit être divisé pour qu'une faible proportion aille au détecteur ELS et le reste au collecteur de fractions.

Les détecteurs MS identifient les composés séparés de l'échantillon sortant de la colonne en fonction de leur masse et du spectromètre de masse. La spectrométrie de masse est l'une des méthodes d'analyse moléculaire les plus sensibles et les plus sélectives. Elle fournit des informations sur la masse moléculaire ainsi que sur le schéma de fragmentation de la molécule d'analyte, informations précieuses pour confirmer l'identité de l'analyte. Différents types de systèmes MS incorporant différents types d'interfaces sont disponibles. Les interfaces les plus utilisées sont l'électrospray (ESI) et l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). Chaque interface est associée à différents champs d'application, capacités de débit, sensibilité et linéarité de réponse. Comme pour les détecteurs ELS, la spectrométrie de masse est une technique destructrice. Par conséquent, le débit doit être divisé pour qu'une petite partie entre dans le détecteur et que la partie principale aille dans le collecteur de fractions.

Diviseurs de débit

Pour les détecteurs chimiquement destructifs comme le détecteur MS ou le détecteur ELS, une partie du débit provenant de la colonne doit être séparée du débit principal pour aller au détecteur pour le déclenchement des fractions. Puisque les détecteurs doivent détecter un pic avant que le collecteur de fractions ne se déclenche (délai), le débit divisé doit arriver au détecteur avant que le débit principal n'atteigne le collecteur de fractions. Pour ce faire, la vitesse du débit divisé est augmentée à l'aide d'une « pompe d'appoint » et d'un « solvant d'appoint ».

Les diviseurs de débit peuvent être « passifs » ou « actifs ». Les diviseurs de débit passifs et actifs sont autant efficaces pour échantillonner le débit d'échantillon principal. Le type de diviseur employé dépend donc des préférences de l'utilisateur.

Les diviseurs passifs impliquent l'utilisation de tubulures restrictives telles qu'une ligne à retard et des « raccords en T » pour maintenir une plage de débit et un rapport de division spécifiques.

Un diviseur de débit actif comporte deux circuits fluidiques entièrement séparés et une vanne de commutation rapide qui transfère une partie du débit principal dans le débit d'appoint, où elle est diluée selon un rapport de division programmé.

Tubulure

Plusieurs considérations doivent être prises en compte lors du choix de la tubulure appropriée pour le chemin fluidique. Tout d'abord, l'intégrité de la tubulure du circuit fluidique du système dépend en grande partie de l'adaptation du matériau de fabrication de la tubulure et de l'application. La tubulure peut être en polymère technique haute performance PEEK (polyétheréthercétone) ou en acier inoxydable. Elle devrait être chimiquement compatible avec l'échantillon et la phase mobile pour éviter que l'échantillon ne colle à la surface de la tubulure, entraînant une perte d'échantillon et un faible rendement ou une contamination inter-échantillons.

La tubulure du système doit également pouvoir supporter les pressions et les températures de fonctionnement du circuit fluidique, bien que le contrôle de la température du chemin fluidique ne soit pas souvent utilisé avec la chromatographie de purification et ne pose donc pas de problème significatif.

Lorsque l'on considère les limites de pression, les systèmes de purification chromatographique peuvent être séparés en trois zones : la zone « basse pression » entre le réservoir de solvant et la pompe ; la zone « haute pression » entre la pompe et l'orifice d'entrée de la colonne ; et une seconde zone « basse pression » entre l'orifice de sortie de la colonne et le réservoir à déchets ou le collecteur de fractions après le détecteur. Les tubulures de chaque zone ont des critères particuliers de maintien de la pression. La sélection d'un matériau de tubulure inapproprié dans une zone de pression présentant des exigences critiques peut non seulement entraîner de mauvaises performances et des problèmes chromatographiques, mais également des fuites et des ruptures.

Deux variables doivent être prises en compte ; le diamètre intérieur et la longueur de la tubulure. En général, plus le diamètre intérieur est petit, plus la vélocité interne est élevée et plus la dispersion de l'échantillon est faible, ce qui permet à l'échantillon de rester aussi concentré que possible. Cependant, à mesure que le diamètre intérieur de la tubulure diminue, la pression créée par la tubulure peut augmenter considérablement, entraînant potentiellement une contre-pression du système incompatible avec la cellule de détection du détecteur ou d'autres composants du système. Lorsque des longueurs de tubulure de diamètres intérieurs différents sont raccordées, un volume mort peut se former au niveau de la jonction ou à proximité. Ce volume mort peut entraîner des problèmes de finesse de pics et de contamination inter-échantillons, car les volumes ne sont pas suffisamment balayés par le fluide ou la phase mobile.

En ce qui concerne la longueur de la tubulure, plus le volume du circuit fluidique produit est important, plus l'échantillon risque de se diluer dans la phase mobile et les composants séparés de fusionner à nouveau. La longueur des tubulures peut également contribuer aux pressions du système, aux volumes de délai et aux volumes hors colonne. Pour éviter ces problèmes, ajustez la longueur de la tubulure.

Les systèmes de purification préparative à grande échelle fonctionnent généralement à des débits élevés. Pour modérer la contre-pression provoquée par ces débits, il est important de raccorder au système de purification une tubulure du diamètre approprié, afin de garantir des résultats chromatographiques d'une qualité élevée. Une gamme de diamètres de tubulure est proposée pour des débits allant de 0,05 mL/min à 130 mL/min.