Guide complet pour l’hydrolyse et l’analyse des acides aminés

L’analyse des acides aminés par chromatographie liquide et détection optique nécessite une préparation supplémentaire des échantillons, car la plupart des acides aminés sont dépourvus de chromophore et ne peuvent donc pas être détectés. Ainsi, il faut donc réaliser une dérivatisation suite à l’hydrolyse. Cette section explique comment préparer les hydrolysats de protéines ou de peptides en vue de leur dérivatisation à l’aide de la méthode AccQ•Tag de Waters.

Pour dérivatiser un échantillon hydrolysé de manière fiable, les éléments suivants doivent être pris en compte :

• Élimination des particules
• Détermination de la masse de l’échantillon pour la dérivatisation
• Détermination de la nécessité d’une neutralisation de l’échantillon
• Utilisation d’un excès de réactif de dérivatisation selon la masse de l’échantillon

Les sujets suivants sont abrégés par nécessité. Pour obtenir plus d’informations et des conseils sur la solution de dérivatisation AccQ•Tag, rendez-vous sur www.waters.com/AAA.

Une centrifugation peut être nécessaire en cas de quantités importantes de particules ou de lipides flottant à la surface. Elle facilite le prélèvement d’une aliquote d’hydrolysat limpide pour la dérivatisation.

Pour les gros échantillons tels que les hydrolysats d’analyse de produits alimentaires, une filtration des particules peut suffire. Le volume d’échantillon récupéré peut dépendre du matériau du filtre utilisé. Ce facteur doit donc faire l’objet d’une sérieuse réflexion afin d’obtenir des résultats objectifs. Contactez le fabricant du filtre pour plus de détails sur les performances du filtre dans cette application.

La méthode AccQ•Tag est une technique de dérivatisation précolonne pour l’analyse des acides aminés issus de peptides et de protéines hydrolysés. La méthode AccQ•Tag consiste à :

• utiliser le réactif AccQ•Tag Ultra ou AccQ•Fluor de Waters pour dérivatiser les acides aminés ;
• séparer les dérivés à l’aide d’une méthode HPLC ou UPLC en phase inverse en gradient ;
• quantifier avec exactitude les dérivés à l’aide d’étalons d’acides aminés externes et de la détection optique.

Le carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyle (AQC) réagit avec les amines primaires et secondaires. Le réactif AQC en excès réagit avec l’eau pour former la 6-aminoquinoline (AMQ). L’AMQ réagit lentement avec l’excès de réactif AQC pour former un composé bisurée. Ces produits secondaires n’interfèrent pas avec la séparation, l’identification et la quantification des acides aminés contenus dans les hydrolysats de peptides ou de protéines. Les dérivés sont stables pendant plusieurs jours, ce qui permet de traiter les échantillons par lots ou de répéter une analyse si nécessaire.

Depuis de nombreuses années, des études approfondies ont été réalisées pour garantir l’exactitude de la réaction de dérivatisation AccQ•Tag. La réaction chimique nécessite à la fois un excès molaire de réactif de dérivatisation et un pH basique (8 à 10) pour assurer une dérivatisation complète de tous les acides aminés. Des stratégies ont été développées pour traiter ces facteurs essentiels.

Pour la réaction même, l’échantillon est généralement dilué 10 fois, et on injecte sur la colonne 1 µL sur un volume total de dérivatisation de 100 µL. Comme tous les acides aminés ne sont pas présents en même quantité dans une dérivatisation, le volume de l’échantillon doit être suffisant pour que l’acide aminé le moins abondant ait un impact sur la limite de détection ou de quantification. Pour obtenir une quantification exacte, il est recommandé de dériver au moins 1 pmol de l’acide aminé le moins abondant pour un volume d’injection maximum de 1 µL. Pour déterminer la quantité d’échantillon nécessaire, effectuez le calcul suivant :

Exemple de calcul :
Pour un échantillon avec une concentration de protéine à 1,0 mg/mL :
Estimez la quantité d’échantillon nécessaire pour l’acide aminé le moins abondant. Dans cet exemple, nous supposons que 0,03 mg/mL est nécessaire pour injecter sur la colonne 1 pmol de cet acide aminé.

Convertissez la quantité en mg en moles. La masse moléculaire moyenne d’un résidu d’acide aminé dans une protéine est de 110.

Il s’agit de la concentration estimée de l’acide aminé le moins abondant dans cet échantillon.

Le calcul donne une dilution de facteur 27 (10 ÷ 0,37 = 27).

L’hydrolysat nécessite une dilution de facteur 27 avant la dérivatisation. Par exemple : 5 µL d’hydrolysat d’échantillon peuvent être dilués dans 135 µL de HCl 0,1 N pour obtenir la valeur cible.

Enfin, une aliquote de 10 µL de la dilution ci-dessus peut être transvasée dans le flacon de dérivatisation.

Pour garantir une dérivatisation complète des acides aminés contenus dans l’hydrolysat avec le réactif AccQ•Tag, l’échantillon doit être tamponné à un pH compris entre 8,2 et 10,1. Si l’hydrolysat acide n’est pas correctement neutralisé et que le pH tombe en dessous de 8,2, la dérivatisation sera incomplète. L’effet du pH varie pour chaque acide aminé. Notez que tous les acides aminés ne sont pas affectés de la même manière. Les acides aminés acides, tels que l’acide glutamique et l’alanine, sont plus impactés que la sérine ou la phénylalanine. Le pH est un facteur critique pour obtenir une quantification exacte de tous les acides aminés de l’échantillon d’origine.

• Si la solution d’acides aminés est dissoute dans du HCl 0,1 N, vous pouvez directement transvaser 10 à 20 µL d’échantillon dans le mélange de dérivatisation sans ajustement du pH. Remarque : Veillez toujours à ce que le réactif de dérivatisation disponible soit présent en excès, comme décrit ci-dessous.
• Si la solution d’acides aminés est plus concentrée en acide (HCl > 0,1 N), elle doit être neutralisée avec un volume égal d’hydroxyde de sodium à la même concentration. Cette opération peut être effectuée par addition de volume global ou intégrée à l’étape de dérivatisation.
  • Remplacez la quantité requise de tampon de borate par du NaOH pour neutraliser le HCl dans l’échantillon.
  • Dans le mélange du flacon de dérivatisation, ajoutez 10 µL de NaOH xM et 60 µL de borate. Ajoutez 10 µL de l’échantillon d’acides aminés (dans du HCl xN). Dérivatisez avec 20 µL de réactif AccQ•Fluor.
• En cas de doute sur la neutralisation, vous pouvez préparer des échantillons tests et vérifier le pH final à l’aide de bandelettes de pH à usage unique.

AVERTISSEMENT : Si l’échantillon prend une couleur jaune vif lors de l’ajout du réactif de dérivatisation, le pH de l’échantillon est trop bas. Neutralisez avec du NaOH.

Exemple de calcul :
Pour déterminer la quantité de NaOH nécessaire pour la neutralisation, utilisez la formule suivante.
Pour l’échantillon de protéine de l’exemple précédent, concentré à 1,0 mg/mL dans du HCl 6 N et devant être dilué 27x pour garantir un excès suffisant de réactif de dérivatisation, les calculs suivants s’appliquent.

Convertissez la concentration molaire en acide de l’échantillon en µmoles :

Déterminez la concentration finale d’acide dans l’échantillon dilué :

Rappel : 5 µL d’hydrolysat d’échantillon peuvent être dilués dans 135 µL de HCl 0,1 N pour obtenir la valeur cible.

La quantité totale de NaOH nécessaire par dérivatisation est de 0,31 M.

La quantité totale de tampon de borate ajoutée à la dérivatisation étant de 70 µL, il existe deux méthodes de neutralisation :

Ajoutez 10 µL de NaOH 0,31 M et 60 µL de tampon pour chaque dérivatisation.

Dans un flacon séparé, mélangez 600 µL de tampon de borate et 100 µL de NaOH 0,31 M. Mélangez. Ajoutez 70 µL de ce mélange + 10 µL d’échantillon + 20 µL de réactif de dérivatisation AccQ•Tag dans chaque échantillon.

Pour assurer la dérivatisation complète de tous les acides aminés, un excès molaire de facteur 4 à 6 du réactif de dérivatisation AccQ•Tag est nécessaire dans la réaction. Une quantité insuffisante de réactif ne permettra pas la dérivatisation complète de certains acides aminés relativement sensibles. Le taux de dérivatisation d’un acide aminé dépend de ses propriétés chimiques. Par exemple, le rendement de l’alanine peut être significativement affecté par un excès molaire insuffisant de réactif AccQ•Tag, contrairement à la phénylalanine.

Pour déterminer la quantité d’échantillon à ajouter dans le flacon de réactif, nous devons connaître la quantité de réactif présente dans chaque flacon. Le flacon de réactif AccQ•Tag standard contient 3 à 4 mg de réactif. Ceci correspond à environ 10 à 14 µmoles de réactif. Sachant que le réactif est dissous dans 1 mL d’acétonitrile et que l’on utilise 20 µL pour 100 µL de réaction de dérivatisation, chaque récipient de réaction contient entre 210 à 280 nmoles de réactif de dérivatisation.

Comme chaque flacon de réaction contient entre 210 et 280 nmol de réactif et qu’un excès molaire de facteur 4 à 6 est nécessaire pour chaque échantillon, chaque réaction doit contenir au minimum 40 à 140 nmoles d’amines au total.

Exemple de calcul :
Pour un échantillon de protéine, utilisez le poids de l’échantillon et le poids moyen d’un acide aminé pour estimer l’excès nécessaire.

Par exemple, pour une concentration en protéines de 1 mg/mL et une masse moléculaire moyenne de 110, la quantité de protéines dans l’échantillon est déterminée par le calcul suivant :

où la masse moléculaire est convertie de g/mol en µg/µmol, et

    1 mL = 103 µL

    1 mmol = 103 µmol = 106 nmol

Une fois la concentration molaire déterminée, on calcule la quantité d’acides aminés dans l’échantillon.

En utilisant la protéine à 1 mg/mL de l’étape 1 de la section 6.3.1, qui nécessitait une dilution de facteur 27 (5 µL de la solution mère d’hydrolysat + 135 µL de tampon), la quantité en nmol contenue dans 10 µL d’échantillon dilué est calculée comme suit :

3,3 nmol est bien en dessous de la limite de 140 nmol, l’échantillon est donc acceptable.

Commercialisée par Waters Corporation en 1992, la méthode HPLC AccQ•Tag utilise la même étape de dérivatisation précolonne que la méthode AccQ•Tag Ultra introduite en 2006. Le réactif AccQ•Fluor, le carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyle (ACQ), dérivatise des amines primaires et secondaires en une seule étape afin d’obtenir des adduits fluorescents très stables. Nous proposons la méthode AccQ•Tag sous forme de système comprenant des réactifs préemballés et une documentation exhaustive. Le système de chimie AccQ•Tag contient les éléments nécessaires à la réalisation d’un maximum de 250 analyses des acides aminés présents dans des hydrolysats de protéines et de peptides.

Le kit de dérivatisation AccQ•Tag contient cinq jeux de réactifs de dérivatisation, contenant chacun un flacon des réactifs suivants :

• Tampon de borate AccQ•Fluor – ajouté aux échantillons pour garantir un pH optimal pour la dérivatisation
• Réactif en poudre AccQ•Fluor – carbamate de 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyle, ou AQC, un réactif de dérivatisation (livré à sec pour une stabilité maximale)
• Diluant de réactif AccQ•Fluor – acétonitrile, utilisé pour reconstituer le réactif de dérivatisation.

La solution d’analyse des acides aminés par UPLC de Waters est une solution globale conçue pour une analyse des acides aminés clé en main. La résolution des acides aminés dérivatisés précolonne est réalisé sur un système ACQUITY UPLC de Waters à l’aide des éléments inclus dans le kit AccQ•Tag Ultra, à savoir une colonne UPLC en phase inverse, des éluants et des méthodes. Une réaction de dérivatisation robuste, des lignes de base chromatographiques stables et une meilleure résolution des acides aminés contribuent à garantir des résultats de quantification exacts, fidèles et constants.

La solution d’analyse des acides aminés par UPLC comprend les éléments suivants :

• Consommables AccQ•Tag Ultra de Waters, y compris la colonne, les réactifs et les éluants, tous testés par QC pour l’analyse des acides aminés
• Logiciel Empower 2, comprenant des projets, méthodes et des rapports d’analyse préconfigurés
• Toute la documentation nécessaire pour le système complet et ses applications

Le système ACQUITY UPLC de Waters prend en charge trois détecteurs optiques différents : détecteur UV programmable, détecteur PDA et fluorimètre.

La solution d’analyse des acides aminés par UPLC comprend deux méthodes complètes utilisant les mêmes instruments et les mêmes chimies. La première est adaptée aux acides aminés dérivés des hydrolysats de protéines. Quant à la seconde, elle convient au plus grand nombre d’acides aminés libres présents dans les échantillons issus de procédés tels que les bouillons de culture cellulaire ou de fermentation. Les méthodes se différencient par la dilution de l’éluant A AccQ•Tag Ultra et la température de la colonne de séparation. L’éluant A et l’éluant B ne requièrent aucun ajustement de pH ou de modification de la composition.

L’analyse des acides aminés des protéines permet à la fois de déterminer les structures et de mesurer la quantité totale de protéines dans un échantillon. L’échantillon est hydrolysé avant l’analyse. Pour les analyses structurales, les rapports molaires observés des acides aminés sont comparés aux valeurs attendues à partir de la séquence.

Pour l’analyse quantitative, on additionne le poids des acides aminés. Cette mesure de la concentration en protéines est utilisée pour calculer les coefficients d’extinction lorsque la composition de l’échantillon interfère avec les analyses de protéines courantes. Le pourcentage en poids de chaque acide aminé et la masse totale de protéines sont utilisés pour évaluer la valeur nutritive des produits destinés à l’alimentation humaine et animale. La solution d’analyse des acides aminés UPLC de Waters permet de réaliser des analyses en routine robustes pour toutes ces applications.