Guide complet pour l’hydrolyse et l’analyse des acides aminés

Il peut s’avérer difficile de séparer, d’identifier et de quantifier avec précision les acides aminés dans le cadre de la recherche, du développement et de la commercialisation de produits biothérapeutiques ou destinés à l’alimentation humaine et animale. Ces applications nécessitent toutes une hydrolyse adéquate des échantillons, première étape importante du processus d’analyse des acides aminés liés sous forme de peptides ou de protéines. L’hydrolyse permet d’analyser les acides aminés libérés, qui peuvent être séparés par chromatographie à échange d’ions ou en phase inverse.

Compte tenu des difficultés que pose le processus de préparation des échantillons, ce document a été rédigé dans le but de fournir des directives utiles pour l’hydrolyse. Les informations contenues dans ce document font uniquement office d’introduction au processus. Vous devrez peut-être adapter les méthodes d’hydrolyse décrites à la nature et à la complexité de vos échantillons. Si vous souhaitez en savoir plus ou rencontrez des difficultés avec l’hydrolyse ou une procédure spécifique, vous devez contacter le fabricant de votre instrument d’hydrolyse ou l’agence compétente, à savoir l’Association of Official Analytical Chemists, ou AOAC. Waters n’est pas en mesure de fournir des recommandations sur des types d’échantillons spécifiques.

Pour analyser les échantillons hydrolysés (acides aminés libérés) par HPLC ou UPLC, Waters propose de nombreuses solutions utilisant la dérivation pré-colonne en vue d’analyser les acides aminés par détection optique. Dans la mesure où elle fait partie intégrante du processus, ce guide comprend une brève introduction à la méthode HPLC (AccQ•Tag) et à la solution d’analyse des acides aminés par UPLC (AccQ•Tag Ultra) de Waters. Ce document ne contient pas d’informations relatives à la méthode d’analyse des acides aminés Pico-Tag (dérivation pré-colonne par isothiocyanate de phényle) de Waters. Bien que la méthode Pico-Tag soit toujours disponible, les méthodes utilisant la solution AccQ•Tag offrent des avantages significatifs en termes de performances et sont recommandées pour les nouvelles applications.

Remarque : Ce document est consacré à l’hydrolyse et à l’analyse des acides aminés à partir de protéines/peptides purifiés et de produits destinés à l’alimentation humaine et animale. Il n’a pas vocation à traiter des cas de l’analyse des acides aminés dans les échantillons d’urine, de plasma, de produits de nutrition parentérale totale ou de milieux de culture cellulaire. Pour plus d’informations sur ces applications, rendez-vous sur www.waters.com/AAA et sur www.waters.com/Kairos.

Recommandations et directives générales relatives à l’analyse

Les acides aminés étant omniprésents dans l'environnement, une contamination de fond peut facilement ajouter 20 pmol, voire plus, de certains acides aminés à l'analyse d'échantillon souhaitée, notamment de la sérine (Ser) et de la glycine (Gly). Certaines précautions peuvent limiter cette contamination. Par ailleurs, si une quantité suffisante d'échantillon est hydrolysée afin de fournir un minimum de 200 pmol par acide aminé, la contribution de la contamination de fond peut être limitée à moins de 10 %. Néanmoins, pour tirer parti de la sensibilité des techniques de dérivation et des systèmes chromatographiques actuels, dont les limites de détection peuvent être inférieures ou égales à 1 pmol, l'application de bonnes mesures d'hygiène et techniques de laboratoire est essentielle. Les sources de contamination sont partout, les plus courants étant la verrerie mal nettoyée, les animaux de laboratoire, la poussière en suspension dans l'air, les empreintes digitales et le talc.

Bien qu'il n'existe pas de système idéal universel pour améliorer la qualité globale des analyses d'acides aminés à faible concentration, les considérations et pratiques suivantes peuvent y contribuer :

• Pyrolysez tous les tubes à hydrolyse de 6 x 50 mm (réf. : WAT007571) pendant une nuit à 500 °C pour que le verre soit le plus propre possible. Après avoir retiré les tubes du four refroidi, couvrez-les d'une feuille d'aluminium (nettoyée à l'acétone) et rangez-les dans un endroit couvert.
• Sachez que des contaminants peuvent être introduits par le biais de pipettes, d'embouts jetables, de seringues et d'autres accessoires utilisés lors de la procédure.
• Avant l'hydrolyse, manipulez les tubes avec des gants propres non poudrés et des pinces propres. Il peut convenir de porter un masque chirurgical.
• Utilisez toujours des réactifs frais. Tout réactif peut constituer une source de contamination. Il est recommandé de répartir les flacons dans des récipients propres plus petits immédiatement après ouverture.
• Vérifiez chaque semaine la qualité des réactifs en procédant à la dérivation de blanc de contrôle.
• Dans la mesure du possible, réalisez toujours l'hydrolyse en phase vapeur. L'utilisation de HCl non pur peut compromettre la fiabilité de l'hydrolyse. Nous avons obtenu les résultats les plus constants avec du HCl à ébullition constante. Le HCI concentré de haute pureté et de qualité réactif n'est probablement pas aussi propre et contient des niveaux significativement plus élevés de chlore que le HCl à ébullition constante.
• Testez l'eau et les composants du tampon en tant qu'échantillons de référence pour vérifier s'ils contribuent à la contamination de fond. Par exemple, l'eau bidistillée en laboratoire contribue souvent à des niveaux inacceptables d'acides aminés. Pour une qualité d'eau optimale, nous vous recommandons fortement d'utiliser un système de purification (18,2 mΩ-cm d'eau).
• Un blanc de contrôle approprié pour l'hydrolyse est un tube à échantillons qui a été traité exactement de la même manière qu'un échantillon, sans omettre l'étape d'hydrolyse.