Guide complet pour l’hydrolyse et l’analyse des acides aminés

L’expression « protéine et peptide » désigne un échantillon relativement pur issu d’un bioréacteur ou d’un processus de purification. Ces échantillons incluent peu d’autres matières non protéiques, voire pas du tout. La formation d’acides aminés libres à partir d’une protéine ou d’un peptide intact est une étape critique pour générer des données d’analyse d’acides aminés exploitables et exactes. Pour ce faire, il est nécessaire de décomposer ou d’hydrolyser une protéine/un peptide de sorte à libérer chacun des acides aminés qui le composent.

Cette section présente les procédures de base pour l’hydrolyse de protéines et de peptides en phase vapeur et liquide, en mettant l’accent sur les précautions à prendre en amont pour une analyse optimale.

D’autres sous-sections abordent des alternatives pour l’analyse d’échantillons particuliers contenant des acides aminés incompatibles avec les techniques classiques d’hydrolyse acide (HCl), comme le tryptophane et la cystéine/cystine.

Dans cette section, nous nous concentrons sur l’hydrolyse acide par HCl, qui est la méthode la plus couramment utilisée pour préparer les échantillons d’acides aminés. Cependant, pour que les échantillons de protéines soient complètement hydrolysés (quelle que soit la méthode), plusieurs facteurs doivent être pris en compte. Les tampons de neutralisation, ainsi que les éventuelles matières solides présentes, doivent être pris en compte lors de l’estimation de la procédure. De plus, la vitesse et l’étendue de l’hydrolyse varient en fonction des acides aminés présents dans les protéines. Il est donc nécessaire d’étudier la chronologie de l’hydrolyse et de valider les méthodes globales. La bonne manipulation des échantillons pendant l’hydrolyse garantit des résultats de haute qualité. Les difficultés les plus courantes dans ce type d’analyse proviennent généralement d’une technique incorrecte ou peu soignée. Pour garantir l’efficacité de l’hydrolyse avec cette méthode, il faut d’abord répondre à quatre questions :

1. La dilution de l’échantillon est-elle nécessaire ?
2. Quel est le volume d’échantillon à introduire dans les tubes à hydrolyse ?
3. Quel est le volume spécifique d’acide à ajouter dans les tubes ? (hydrolyse en phase liquide uniquement)
4. Quelle quantité d’étalon interne utiliser, le cas échéant ?

Les sections suivantes détaillent les éléments à déterminer et fournissent des exemples de calcul, le cas échéant.

2.1.1 Considérations préliminaires

À moins que l’échantillon ne soit limité, l’hydrolyse doit contenir entre 2 et 25 µg de protéines afin de minimiser les effets d’une contamination. Quel que soit le mode d’hydrolyse, la quantité recommandée est de 20 µg.

• L’échantillon ne doit pas contenir trop de matières solides, qui pourraient causer des interférences lors de l’hydrolyse en phase vapeur.
• Si d’autres matières solides sont présentes dans l’échantillon avec la protéine, leur poids doit être ajouté à celui de la protéine pour déterminer la concentration de matières solides par volume d’acide.
• La concentration nette d’acide dans l’hydrolyse doit être d’environ 6 N.
• L’utilisation d’un étalon interne (par exemple, Nva [norvaline]) est préférable aux étalons externes.
• L’étalon interne doit être ajouté avant l’hydrolyse, soit pendant la préparation de l’échantillon, si le cas s’y prête, soit à l’acide qui est ensuite introduit dans les tubes à hydrolyse. En général, la quantité d’étalon interne est calculée de sorte à correspondre à la quantité d’étalon utilisée pour l’étalonnage.
• On ajoute du phénol à l’acide utilisé pour l’hydrolyse afin d’éliminer l’oxygène.

2.1.2 Dilution de l’échantillon (si nécessaire) avant l’hydrolyse liquide

• Ajoutez un minimum de 10 µL d’échantillon (dilué ou non) dans le tube à hydrolyse. Un volume moindre entraînera une quantité inacceptable d’erreurs du fait de l’incertitude volumétrique.
• Lors de l’hydrolyse, il doit également y avoir un excès d’acide correspondant à 10 à 100 fois le poids de l’échantillon. Un échantillon trop concentré peut compromettre l’efficacité de l’hydrolyse. Dans ce cas, l’échantillon doit être dilué. Assurez-vous que l’excès pondéral d’acide par rapport aux matières solides est d’un facteur d’environ 100 pour l’hydrolyse liquide.
• Assurez-vous que l’excès molaire d’acide par rapport aux tampons de l’échantillon est égal à un facteur 25. Multipliez par 3 la quantité molaire de tampon phosphate pour tenir compte des trois groupements titrables.
• Le volume total d’hydrolyse ne doit pas dépasser 50 % de la capacité totale du tube ou du récipient à hydrolyse. Pour les tubes de 6 x 50 mm, le volume maximal recommandé est de 100 µL. Incluez les volumes d’acide et d’étalon interne dans ce volume total final.

Exemple de calcul : déterminer la dilution requise

Pour une protéine à 5 mg/mL dans une solution de NaCl à 150 mM, on détermine la quantité de matières solides (sels compris) et le facteur de dilution.

La première étape consiste à déterminer la quantité totale de matières solides dans l’échantillon. Pour ce faire, on multiplie la concentration en protéines (µg/µL) par la concentration pondérale du sel (concentration x PM) pour obtenir la quantité totale de matières solides.

L’étape suivante consiste à déterminer la dilution nécessaire pour obtenir 20 µg de protéine (dans 20 µL). On multiplie alors la quantité/le volume souhaité par l’inverse de la concentration de l’échantillon. On obtient donc un rapport de dilution de 1:5 pour l’échantillon décrit ci-dessus.

2.1.3 Volume d’échantillon à introduire dans le tube à hydrolyse

Le volume total recommandé pour une hydrolyse est de 100 µL (pour des tubes de 6 x 50 mm), le volume d’échantillon étant compris entre 10 et 20 µL. Ce volume d’échantillon, dilué ou non, dépend du type d’hydrolyse réalisé et doit être préparé comme suit :

• Hydrolyse en phase vapeur : séchez l’échantillon sous vide jusqu’à obtenir une couche mince au fond du tube.
• Hydrolyse en phase liquide : ajoutez le volume nécessaire pour hydrolyser au moins 2 µg de protéines dans le tube à hydrolyse, ou bien, à partir d’une plus grande quantité d’échantillon (jusqu’à 25 µg de protéines), reconstituez-le avec une quantité suffisante de HCl 0,1 N pour transférer environ 0,2 µg de protéines (idéalement dans 10 µL) à l’hydrolyse.

Il est important de noter, encore une fois, que plus la quantité de protéines dans l’aliquote d’échantillon est faible, plus l’analyse sera sujette à contamination.

2.1.4 Volume d’acide à introduire dans l’hydrolyse

Le volume d’acide ajouté à l’hydrolyse est un critère essentiel, notamment pour l’hydrolyse en phase liquide. Vous trouverez ci-après des recommandations relatives au volume d’acide, illustrées par un exemple détaillé.

• Hydrolyse en phase vapeur :
  • Ajoutez 200 µL de HCl 6 N contenant 0,1 à 0,5 % de phénol au fond du récipient à hydrolyse. (Si vous utilisez une station de travail d’hydrolyse disponible dans le commerce, ajoutez le volume recommandé par le fournisseur. Pour plus d’informations, consultez les sections 4 et 5.)
• Hydrolyse en phase liquide (voir exemple ci-dessous) :
  • Vérifiez que la concentration finale en acide est de 6 N une fois le phénol ajouté.
  • Assurez-vous que l’excès molaire d’acide est suffisant (facteur ~25) pour neutraliser les tampons.
  • Assurez-vous que l’excès pondéral d’acide par rapport au poids total des matières solides est suffisant (facteur ~100). Intégrez dans votre estimation la matrice de l’échantillon et les autres matières solides en plus de la protéine.

Exemple de calcul : déterminer le volume d’acide à ajouter à une hydrolyse liquide

En suivant les recommandations ci-dessus, la quantité minimale d’acide ajoutée pour une hydrolyse doit être supérieure à 25 fois la concentration du tampon et à 100 fois l’excès pondéral de l’échantillon. Par conséquent, pour déterminer le volume d’acide nécessaire, vous devez calculer les éléments suivants :

1. Quantité de tampon présent
2. Quantité d’acide nécessaire à la neutralisation du tampon dans l’échantillon (25x)
3. Conversion de la quantité d’acide en volume
4. Quantité totale de matières solides dans l’échantillon
5. Quantité minimale d’acide nécessaire pour obtenir l’excès d’acide cible par rapport à l’échantillon (100x)
6. Conversion de la quantité d’acide en volume
7. Quantité totale d’acide nécessaire (somme de la neutralisation et de l’excès)

Pour une protéine à 2,1 mg/mL dans du Na/K₂PO₄ à 2 mM :

Pour déterminer la quantité de tampon dans chaque tube, multipliez la concentration molaire du tampon par le nombre de groupes titrables (trois pour le tampon phosphate), puis par le volume total d’échantillon distribué (ici, 10 µL).

Chaque tube contiendra 60 nmol de tampon.

Ensuite, l’excès de facteur 25 est déterminé en multipliant la quantité par 25.

Le résultat correspond à la quantité molaire d’acide nécessaire à la neutralisation du tampon.

La quantité molaire de tampon nécessaire à la neutralisation doit ensuite être convertie en volume d’acide à ajouter dans chaque tube.

Pour cet échantillon, un volume de 0,25 µL neutralisera efficacement le tampon.

Pour obtenir un excès d’acide de facteur 100 par rapport à l’échantillon, on doit déterminer la quantité totale de matières solides dans l’échantillon. La quantité totale de solides correspond à la somme de la protéine, du tampon et de toute autre matière présente. Dans cet exemple, l’échantillon est une protéine purifiée.

Le calcul consiste à multiplier la concentration en protéines (µg/µL) par la concentration pondérale du sel (concentration x PM) pour obtenir la quantité totale de matières solides.

Selon le calcul, la quantité totale de solides dans cet échantillon est de 24,9 µg.

Pour déterminer l’excès d’acide cible de facteur 100, multipliez la quantité totale de matières solides par 100.

Enfin, convertissez l’excès pondéral en un volume de HCl 6 M à ajouter dans chaque tube en multipliant le poids par la masse molaire de l’acide et par la concentration molaire de l’acide.

Dans cet exemple, 11,4 µL de HCl 6 M fourniront un excès d’acide de facteur 100 par rapport à l’échantillon.

Le volume final d’acide à ajouter dans chaque tube correspond à la somme du volume nécessaire pour neutraliser le tampon de l’échantillon et du volume permettant d’obtenir un excès de facteur 100 :

Un volume de 11,65 µL de HCl 6 M est nécessaire pour assurer une hydrolyse efficace. Ce volume peut être arrondi à un volume pouvant être mesuré avec précision.

2.1.5 Étalon interne

L’utilisation d’un étalon interne compense au mieux la variabilité des réactions d’hydrolyse de chacun des acides aminés de l’échantillon. La norvaline (Nva) est un étalon interne couramment utilisé.

Lors de l’utilisation d’un étalon interne :

• Il peut être préparé et introduit en même temps que l’échantillon.
• Il peut être ajouté séparément de l’échantillon.
• Il peut être préparé et introduit en même temps que l’acide.
• Assurez-vous de préparer l’étalon interne de sorte que le volume d’injection de 1 µL sur l’instrument délivre la même quantité sur la colonne que l’échantillon.

Pour déterminer la quantité d’étalon interne à introduire dans l’échantillon de départ, il faut d’abord calculer la quantité d’étalon interne souhaitée dans l’échantillon final. Pour ce calcul, il est important de prendre en compte l’étape de dérivation.

Exemple de calcul : déterminer la quantité d’étalon interne d’un échantillon

Pour déterminer la quantité totale d’étalon interne, multipliez la quantité d’étalon interne nécessaire dans l’échantillon final par le facteur de dilution de la dérivation et par le volume d’échantillon reconstitué dans le tube à hydrolyse. Dans cet exemple, on a besoin de 25 pmol d’étalon interne dans l’échantillon dérivé final, l’échantillon étant dilué 10x pendant la dérivation et 5x avant la dérivation. Ainsi :

Cela indique que nous avons besoin de 1 250 pmol d’étalon interne dans notre échantillon d’hydrolyse.

Compte tenu du poids moléculaire (mg/mol) et de la conversion de µL en mL, nous constatons qu’il faut ajouter 0,14 mg d’étalon interne pour chaque mL d’échantillon de départ.

2.1.6 Hydrolyse acide en phase vapeur

L’hydrolyse en phase vapeur est recommandée pour les échantillons de protéines ou de peptides relativement purs contenant peu ou pas de particules. Cette approche est réputée offrir une sensibilité optimale. Il est préférable d’utiliser une station de travail d’hydrolyse autonome et automatisée pour ce type d’hydrolyse. Un système automatisé, tel que la station de travail d’hydrolyse Eldex décrite en section 4, gèrera plus efficacement le contrôle du vide, le maintien de la température, les rinçages à l’azote et le séchage des échantillons requis par cette procédure.

Réactifs :

• HCl 6 N avec 1 % de phénol en volume
• Azote (qualité prépurifiée)
• Neige carbonique

Remarque : Pour plus d’informations sur les réactifs, consultez le manuel d’utilisation de la station de travail d’hydrolyse.

Procédure (avec utilisation d’une station de travail automatisée) :

1. Séchez une aliquote contenant 0,5 à 20 µg de protéines dans un tube à hydrolyse de 6 x 50 mm.
2. Ajoutez 200 µL de HCl à ébullition constante contenant 0,5 % de phénol au fond du flacon sous vide (voir précision ci-dessous).
3. Refermez le flacon sous vide après trois étapes de rinçage à l’azote sous vide.
4. Hydrolysez à une température comprise entre 112 et 116 °C pendant 24 heures.
5. Refroidissez le flacon. Éliminez l’excès de HCl de l’extérieur des tubes en les essuyant avec un chiffon de laboratoire. Séchez sous vide.

Précisions :

• Utilisez du phénol cristallisé et placez un cristal (≈0,5 mg) au fond du flacon. Les cristaux sont plus propres et plus stables que le phénol sous forme liquide.
• Pipettez délicatement l’échantillon et l’étalon interne au fond des tubes. Utilisez une seringue pour plus de précision et de facilité.
• Vous pouvez marquer les tubes à l’aide d’une lime ou d’un crayon à pointe diamant.
• Faites attention que des gouttelettes de HCl ne s’écoulent pas dans les tuyaux. Maintenez les tubes en position verticale dans le flacon sous vide. Si vous avez moins de 10 à 12 tubes, ajoutez des tubes vides pour assurer leur maintien. Il peut être s’avérer utile d’incliner légèrement le flacon pendant le refroidissement.

Remarque : Le HCl prend souvent une teinte marron après l’hydrolyse. Cela est dû au phénol. Vous pouvez éliminer cette coloration des flacons et des couvercles avec de l’éthanol ou de l’acétone.

ATTENTION : Il peut être difficile de distinguer les problèmes d’hydrolyse des problèmes de dérivation.

2.1.7 Hydrolyse acide en phase liquide

L’hydrolyse en phase liquide est utilisée avec des échantillons plus complexes, qui peuvent contenir des particules ou corps étrangers susceptibles de causer des interférences en phase vapeur. Globalement, cette approche est réputée moins sensible. Toutefois, elle peut donner de bons résultats lorsqu’elle est appliquée avec soin et précision.

• Équipement et réactifs nécessaires pour cette méthode :
• Balance analytique
• Four ou bloc chauffant capable de maintenir la température de consigne à ±0,1 °C
• Mélangeur vortex
• Pipettes jaugées
• Micropipettes à volume variable
• Tubes à hydrolyse de 6 x 50 mm avec bouchon (recommandés)
• Source d’azote pour le rinçage
• HCl 6N

Mode opératoire :

Avant de commencer –

Pesez les échantillons pour environ 20 mg de protéines à 0,1 mg près dans des tubes à hydrolyse ou transférez les échantillons dilués dans des tubes (comme calculé en sections 2.1.3 et 2.1.4). Habituellement, on utilise un volume total de 10 µL. Mélangez.

1. Ajoutez dans les tubes à hydrolyse le volume d’étalon interne calculé en section 2.1.5. Mélangez.
2. Ajoutez un excès de HCI 6 N (calculé en section 2.1.4, étape 3), mélangez et purgez à l’azote pendant 30 secondes. Bouchez immédiatement.
3. Placez dans le four à 110 °C pendant 24 heures. (Ces paramètres doivent être le résultat d’une étude de l’évolution de la protéine et des acides aminés d’intérêt dans le temps.)
4. Retirez du four et laissez refroidir.
5. L’échantillon est prêt pour la dérivation.

2.1.8 Résolution des problèmes d’hydrolyse acide

Plusieurs acides aminés seront compromis si l’hydrolyse n’est pas correctement effectuée. Par exemple :

• De faibles rendements en méthionine (Met) et en tyrosine (Tyr) sont généralement le signe d’un problème d’hydrolyse, c’est-à-dire du HCl impur ou une élimination inadéquate de l’oxygène. L’un ou l’autre de ces problèmes peut entraîner la formation de chlore provoquant une chloration de la Tyr.
• De faibles rendements en acides aminés hydrophobes (Ile, Leu, Val et autres) peuvent indiquer une hydrolyse incomplète, en raison d’une température du four trop basse, d’une hydrolyse trop courte (en particulier pour les hydrolyses rapides à haute température) ou d’une perte de HCl résultant d’une évacuation excessive après la purge à l’azote (cela peut être un problème spécifique à l’échantillon ; certaines séquences, comme Ile-Val-Leu, sont extrêmement résistantes à l’hydrolyse). Vérifiez qu’il reste du HCl liquide dans le flacon avant de le placer dans le four. Une quantité trop importante de HCl peut également poser problème. En effet, le liquide peut se condenser dans l’échantillon et entraîner la formation d’un résidu marron, une perte de Tyr et de Met et l’apparition de pics parasites.
• Si vous n’utilisez pas de station de travail d’hydrolyse en phase gazeuse, vérifiez que la configuration pour l’hydrolyse est adaptée. La totalité du flacon à hydrolyse doit être incluse dans le four. L’utilisation d’un bloc chauffant renfermant uniquement la moitié inférieure du flacon entraînera une condensation de HCl liquide en haut du tube et compromettra l’efficacité de l’hydrolyse. 

L’analyse du Trp dans les protéines et les peptides est complexifiée par l’instabilité de cet acide aminé dans des conditions normales d’hydrolyse avec HCl 6N. D’autres procédures d’hydrolyse peuvent être utilisées pour obtenir du Trp intact à des fins d’analyse :

• Hydrolyse par acide sulfonique (par exemple, acides méthylsulfonique et paratoluènesulfonique)
• Hydrolyse basique et utilisation de réactifs thiols dans le HCl, tels que le 2-mercaptoéthanol (BME) ou l’acide thioglycolique

2.2.1 Hydrolyse par acide méthylsulfonique (MSA) pour l’analyse du tryptophane

Le réactif MSA doit être ajouté directement dans les tubes d’échantillon de 6 x 50 mm (hydrolyse en phase liquide), car l’acide n’est pas volatil. L’ajout de méthanol et la neutralisation après hydrolyse permettent d’obtenir de bons résultats pour le tryptophane et ne causent aucune interférence lors du processus de dérivation ultérieur. La figure 2 illustre la réaction du MSA avec une protéine.

Remarque : cette procédure peut également être utilisée pour la détermination de la Cys et de la Met. Elle convertit la Cys en Cya et la Met en sulfone de méthionine.

Remarque : la Tyr et le Trp et ne sont pas stables lors d’une réaction d’oxydation par acide performique, méthode traditionnellement utilisée pour l’analyse de la Cys et de la Met.

2.2.1.1 Équipements et réactifs

• MSA 4 M contenant 0,2 % (p/v) de HCl de tryptamine
• Eau ultrapure
• Méthanol-eau-triéthylamine, 2:2:1
• Tubes à hydrolyse de 6 x 50 mm
• Dispositif de séchage sous vide
• Bain-marie ou bloc chauffant

2.2.1.2 Procédure

1. Ajoutez 20 µL de MSA 4 M contenant 0,2 % (p/v) de HCl de tryptamine dans chaque tube à échantillon de 6 x 50 mm contenant un échantillon séché.
2. Ajoutez 100 µL d’eau dans le flacon de réaction.
3. Fermez hermétiquement en vue de l’hydrolyse.
4. Hydrolysez à 110 °C pendant 20 à 24 heures.
5. Refroidissez le flacon, ouvrez-le et ajoutez 22 µL de KOH 4 M (suffisamment pour la neutralisation) dans chaque tube d’échantillon.
6. Séchez sous vide.
7. L’échantillon est prêt pour la dérivation.

Précisions :

Vérifiez l’absence d’interférences avec des blancs de contrôle.

• Utilisez du MSA pur et frais.
• Il se peut qu’une partie des interférences masquant parfois la Tyr ou la Val provienne de la tryptamine utilisée comme additif dans l’acide du commerce. Dans ce cas, envisagez d’utiliser du MSA sans additif.
• Utilisez du KOH frais (ou du NaOH, selon la propreté dans votre laboratoire). Testez la capacité de la base à neutraliser l’acide sur un échantillon test. Ajoutez un volume de base qui minimise l’excès de base.
• Préparez un étalon de Trp à 2,5 mol/mL dans H20. Conservez au congélateur. Mélangez l’étalon de Trp 1:1 avec l’étalon H à des fins d’étalonnage.

MISES EN GARDE :

• Il peut exister des interférences avec la Tyr et la Val. La cause en est inconnue. (Privilégiez le HCI pour l’hydrolyse de la Tyr.)
• De faibles rendements en Met sont dus aux conditions d’hydrolyse.
• Les rendements du Trp et de la Met ne sont pas linéaires en raison du processus d’hydrolyse et non de la procédure d’analyse. Lorsque la quantité hydrolysée diminue, les rendements diminuent. Ce phénomène est amplifié avec la Met.
• Mauvaise reproductibilité des résultats pour l’Arg : cause inconnue.

2.2.2 Hydrolyse basique pour l’analyse du tryptophane

Si l’hydrolyse acide du tryptophane pose des problèmes de stabilité, une alternative consiste à hydrolyser les protéines avec une base.

• NaOH
• Acide acétique
• Eau ultrapure
• Tubes à hydrolyse de 6 x 50 mm
• Dispositif de séchage sous vide
• Bain-marie ou bloc chauffant

1. L’utilisation de tubes en plastique (par exemple en Téflon) peut s’avérer nécessaire pour éviter la formation de silicates pouvant causer des problèmes de solubilisation ou de dérivation.
2. Ajoutez directement 20 µL de NaOH 4 M frais dans le tube à hydrolyse, comme dans la procédure avec MSA décrite ci-dessus.
3. Refermez le tube et chauffez-le à 112 °C pendant 16 heures.
4. Refroidissez l’échantillon et neutralisez l’excès d’acide acétique.
5. L’échantillon est prêt pour la dérivation.
6. Analysez des blancs pour déterminer le niveau de contamination.
7. Vérifiez la méthode à l’aide d’étalons et d’échantillons connus.

La quantification de la cystéine (Cys) dans les échantillons de protéines est complexifiée par l’instabilité de cet acide aminé dans des conditions standard d’hydrolyse acide. Malheureusement, contrairement au Trp, les procédures alternatives d’hydrolyse acide ou basique ne permettent pas d’obtenir des résultats satisfaisants. Deux procédures courantes pour l’analyse de la Cys impliquent la conversion de la cystéine en dérivés plus stables. La première procédure est l’alkylation du groupe sulfhydryle. La seconde est une oxydation en acides sulfonique, cystéique ou cyanurique (Cya), stables en milieu acide.

AVERTISSEMENT : Une autre complication de l’analyse de la Cys est que la majeure partie de l’acide aminé est présente sous forme d’un dimère, la cystine (Cys2), qui doit être réduite en cystéine avant toute procédure d’alkylation.

Il est important de noter que ces procédures spécifiques sont effectuées avant l’étape d’hydrolyse acide standard.

L’acide performique est un puissant réactif oxydant qui convertit quantitativement la cystéine (Cys) et la cystine (Cys2) en acide cystéique (Cya) (Figure 4). De nombreuses publications font référence à l’utilisation de ce réactif dans une grande variété de conditions et de procédures. La procédure suivante est basée sur celle de Tarr, G.E., 1986.

Remarque : Cette procédure permet d’obtenir une exactitude de résultats optimale pour la cystéine et la méthionine.

• Dispositif de séchage sous vide
• Tubes à hydrolyse de 6 x 50 mm avec bouchons
• Acide formique ultrapur
• Peroxyde d’hydrogène ultrapur
• Balance analytique
• Micropipettes

1. Séchez l’échantillon sous vide (0,1 à 10 µg de protéine ou 50 à 2 000 pmol de peptide) dans un tube à hydrolyse de 6 x 50 mm.
2. Mélangez 19 volumes d’acide formique à 97 % avec 1 volume de peroxyde d’hydrogène. Laissez reposer une heure à couvert à 22 °C.
3. Ajoutez 10 µL de ce réactif à l’échantillon séché, laissez reposer 30 minutes à 22 °C et séchez sous vide.
4. Hydrolysez en utilisant la procédure standard avec HCl 6 M (voir section 1.1).

Remarque : La Tyr et le Trp ne sont pas stables pendant cette réaction d’oxydation.

Les procédures d’alkylation sont plus sélectives que l’oxydation à l’acide performique et n’entraînent que peu ou pas de modification des autres acides aminés. Elles conviennent ainsi mieux à l’analyse de la protéine complète, ainsi qu’à d’autres procédures pouvant être réalisées suite à une modification de la Cys, comme l’établissement de cartes peptidiques.

Dans cette méthode, l’alkylation est présentée avec la 4-vinylpyridine. La procédure générale décrite ci-après peut également être adaptée à d’autres agents d’alkylation. En principe, un réactif réducteur doit être ajouté en quantité suffisante à l’échantillon pour convertir la cystine (Cys2) en cystéine (Cys). Après quoi, on ajoute un réactif d’alkylation en excès à l’échantillon réduit (Figure 5).

• Dispositif de séchage sous vide, source de séchage à l’azote ou lyophilisateur
• Flacons refermables
• Balance analytique
• pH-mètre
• Micropipettes
• Pyridyléthylcystéine (PEC) (étalon)
• HCl de guanidine (Gu-HCl)
• Dithiothréitol (DTT)
• 4-vinylpyridine (4-VP)
• Acétate de N-éthylmorpholinium
• Acide acétique ultrapur
• Étalon d’acides aminés (référence : WAT088122)

1. Ajoutez de l’eau à 6,4 mL de N-éthylmorpholinium pour amener le volume à 100 mL.
2. Titrez jusqu’à pH 8,3 avec de l’acide acétique.

La procédure suivante peut être utilisée pour 1 à 1 000 nmol de protéine ou de peptide.

1. Placez l’échantillon dans un flacon refermable. Séchez l’échantillon sous vide ou au N₂ ou lyophilisez-le.
2. Dissolvez l’échantillon dans 1 mL de tampon.
3. Ajoutez 1 g de Gu-HCl. Mélangez.
4. Ajoutez 4 mg de DDT. Mélangez.
5. Recouvrez l’échantillon avec du N₂, fermez hermétiquement et incubez à température ambiante pendant 4 heures.
6. Ajoutez 8 µL de 4-VP, couvrez de N₂, refermez et incubez à température ambiante pendant 4 à 16 heures.
7. Ajoutez 3 mL d’eau.
8. Dessalez.
9. L’échantillon peut maintenant être hydrolysé à l’acide.

Remarque : Le volume de réaction total peut être réduit en réduisant le tampon à 0,25 mL, le Gu-HCl à 250 mg, le DTT à 1 mg et le 4-VP à 2 µL. Cela peut s’avérer pertinent pour un échantillon allant jusqu’à 250 pmol. Après l’alkylation, diluez avec 750 µL de H₂0 et poursuivez.

1. Préparez une solution à 2,5 mM de pyridyléthylcystéine (PEC).
2. Ajoutez 200 µL d’étalon d’acides aminés à 200 µL.
3. Dérivez 10 µL du mélange étalon/PEC combiné.
4. Reconstituez dans 100 µL. Injectez 4 µL pour étalonner au niveau de 250 pmol.

Remarque : 8 µL de 4-VP correspondent à environ 74 µmol. Vous pouvez remplacer la 4-VP par d’autres réactifs d’alkylation (par exemple, l’acide iodoacétique) en utilisant la même concentration de réactif.