Solucionar problemas en la forma de los picos en HPLC

Un problema común en los análisis de HPLC es un cambio en la forma de los picos. Idealmente, los picos deberían ser simétricos, con forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362]. La simetría de un pico se puede cuantificar calculando el factor de asimetría USP (T), como se ilustra en la figura 1. Un factor de asimetría de 1 indica una simetría perfecta, mientras que los valores inferiores a 1 se denominan fronting (frente), y los valores superiores a 1, tailing (asimetría). Muchos métodos establecen el requisito de que los factores de asimetría de todos los picos sean inferiores a un límite especificado. Los factores de asimetría más altos pueden disminuir la resolución de los picos que eluyen estrechamente juntos y dificultar la integración [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362].

Cuando se utiliza un método establecido para analizar un lote de muestras, a veces la forma del pico puede cambiar a lo largo de una serie de inyecciones. Esto puede hacer que los factores de asimetría no cumplan el requisito. Hay varias causas posibles para este problema, incluidos problemas con el sistema HPLC, la fase móvil, la muestra y la columna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, Nueva York, 1989, pp. 385-420]. Al solucionar problemas, un buen punto de partida es analizar detenidamente los cromatogramas para observar si el cambio en la forma de los picos se observa en todos los picos o solo en algunos de ellos. En este último caso, observe las propiedades de los analitos cuyos picos han cambiado y determine en qué se diferencian de las de los analitos cuyos picos no han cambiado. ¿Los analitos problemáticos son básicos o ácidos, mientras que los demás no lo son? Si es así, la causa podría ser un cambio en la carga superficial de la fase estacionaria o un cambio en el pH de la fase móvil. Si los analitos que muestran el cambio de forma de los picos son básicos mientras que los demás no lo son, una causa probable en los métodos de fase reversa es la pérdida de grupos endcapping de la fase estacionaria, lo que aumenta la concentración de grupos de silanol. Los grupos de silanol ionizados en la partícula de base son una causa frecuente de asimetría de los picos para los analitos básicos [D. V. McCalley, Chem. Comm. 59 (2023), pp. 7887-7899].

En el caso de que todos los picos de un cromatograma muestren cambios de forma de los picos similares, una posible causa podría ser el deslizamiento del tubo que conecta la columna al sistema HPLC. Esto puede ocurrir cuando se utilizan conectores de PEEK de ajuste manual. Otra posible causa es la presencia de un volumen muerto en la columna, que puede ocurrir cuando la columna se expone a cambios rápidos de presión o se utiliza en condiciones de pH o temperatura que dan lugar a la hidrólisis de las partículas de soporte de la fase estacionaria. Esto es habitual cuando se utilizan columnas de sílice con fases móviles básicas (pH >7), especialmente a temperaturas elevadas (>30 °C) [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995), pp. 3-19., H. A. Claessens, M. A. van Straten, J. J. Kirkland, J. Chromatogr. A 728 (1996), pp. 259-270]. Una tercera causa posible es la acumulación de componentes de la matriz de la muestra en el sistema HPLC o en la columna. Muchas muestras contienen componentes que pueden precipitar o adsorberse fuertemente en las superficies del sistema y de la columna, como proteínas, lípidos, polisacáridos y surfactantes. Cuando estos componentes se acumulan en las superficies del sistema o de la columna, pueden alterar la distribución del flujo, produciendo cambios en la forma de los picos de todos los picos.

Tenga en cuenta los cromatogramas que se muestran en la figura 2. El cromatograma inicial muestra cinco picos con buenos factores de asimetría, que van de 1,01 a 1,09. Después de 200 inyecciones de muestra , el cromatograma muestra ahora que los cinco picos tienen factores de asimetría aumentados, que van de 1,61 a 1,97. La contrapresión de la columna mostró solo un pequeño aumento (3,5 %) en las 200 inyecciones.

Todos los analitos son neutros en las condiciones de separación, por lo que un cambio en la concentración de grupos de silanol en la superficie de la fase estacionaria no puede ser la causa de los picos de asimetría. La fase móvil solo contenía agua y acetonitrilo, y la temperatura de la columna era de 40 °C, por lo que no es probable que se produzcan volúmenes muertos en la columna. ¿Qué ocurre con la acumulación de componentes de la matriz de muestra en la columna? Las muestras contenían proteínas, así como grasas y azúcares. La columna utilizada para este ejemplo tenía una precolumna integrada extraíble. Cuando se sustituía la precolumna por una nueva, los factores de asimetría de los cinco componentes se restablecían a valores cercanos a 1, como se muestra en el cromatograma inferior. Esto confirma que la causa de la asimetría de los picos era la acumulación de componentes de la matriz de muestra en la columna. Cuando se trabaja con muestras que contienen componentes de la matriz que pueden precipitar o adsorberse fuertemente en la columna, el uso de una columna puede ser una forma relativamente económica de maximizar la vida útil de una columna. Como se muestra en este ejemplo, también es una herramienta útil para identificar la causa raíz de los problemas de forma de los picos.