Cambios en la forma de los picos de una columna utilizada anteriormente

Como se analiza en esta serie, los cambios en la forma de los picos son un problema común en los análisis de HPLC. Idealmente, los picos deberían ser simétricos, con forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362]. La simetría de un pico se puede cuantificar calculando el factor de asimetría USP (T), como se ilustra en la figura 1. Un factor de asimetría de 1 indica una simetría perfecta, mientras que los valores inferiores a 1 se denominan fronting (frente), y los valores superiores a 1, tailing (asimetría). Muchos métodos requieren que los factores de asimetría de todos los picos se encuentren dentro de un intervalo especificado. Los factores de asimetría que se desvían significativamente de 1 pueden disminuir la resolución de los picos que eluyen muy juntos, lo que dificulta la integración [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353-362].

Al configurar la ejecución de un método establecido en una columna utilizada anteriormente, se debe realizar una prueba de idoneidad para verificar si la columna está en buenas condiciones. Esta prueba debe evaluar la capacidad de la columna y del sistema para producir una presión, tiempos de retención, áreas de los picos, anchuras de los picos y simetría de los picos aceptables. Un cambio significativo en cualquiera de estas respuestas con respecto a los resultados obtenidos previamente en la columna podría indicar un problema. En la figura 2 se muestra un ejemplo, en el que se empleó material de referencia de control de calidad (QC) de fase reversa de Waters (número de referencia: 186006363). Este material de referencia, que contiene siete compuestos, se analizó mediante un método de gradiente. Inicialmente (figura 2A), los factores de asimetría USP oscilaban entre 0,90 y 1,27, en un intervalo aceptable. Después de extraer la columna del sistema y volver a realizar la conexión, se llevó a cabo el mismo método de prueba, produciendo el cromatograma que se muestra en la figura 2B. Aunque los tiempos de retención, las áreas de los picos y la presión de la columna fueron similares a los resultados iniciales, los factores de asimetría USP para los siete picos fueron más altos, entre 1,32 y 1,65.

Como se describió en la parte 1, hay varias causas posibles de cambios en la simetría de los picos, incluidos problemas con el sistema HPLC, la fase móvil, la muestra y la columna [J. W. Dolan y L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, Nueva York, 1989, pp. 385-420]. Como se ha comentado anteriormente, un buen punto de partida para la resolución de problemas es analizar detenidamente los cromatogramas para observar si el cambio en la forma de los picos se observa en todos los picos o solo en algunos de ellos. Cuando todos los picos de un cromatograma muestran cambios de forma de los picos similares, como en la figura 2B, las posibles causas incluyen la presencia de un volumen muerto en la columna, la acumulación de componentes de la matriz de muestra en la columna o una conexión incorrecta de la columna al sistema HPLC. Debido a que el problema no se había visto al utilizar la columna anteriormente, es poco probable que la columna tuviera un volumen muerto o una acumulación de matriz de muestra. Esto indica que una conexión incorrecta con el sistema HPLC es la causa más probable. Se han vuelto a colocar las conexiones de la columna y se ha vuelto a realizar el método de prueba de idoneidad. Como se muestra en la figura 2C, los factores de asimetría USP se han restablecido a los valores iniciales. Esto confirma que el problema se debió a una conexión incorrecta de la columna, que provocó un espacio entre la columna y el tubo que la conecta al sistema (consultar la figura 3). Incluso un pequeño espacio es suficiente para causar una distorsión en la forma del pico. Para ver demostraciones de cómo conectar columnas con diferentes tipos de conectores finales a varios sistemas HPLC, consulte la serie de vídeos en esta URL: Cómo conectar las columnas HPLC a los sistemas LC de Waters