Como se comentó en las dos primeras partes, hay varias causas posibles de cambios en la simetría de los picos, incluidos problemas con el sistema HPLC, la fase móvil, la muestra y la columna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385-420]. Como se ha comentado anteriormente, un buen punto de partida para la resolución de problemas es analizar detenidamente los cromatogramas para observar si el cambio en la forma de los picos se observa en todos los picos o solo en algunos de ellos. Cuando solo algunos de los picos de un cromatograma muestran asimetría frontal, como en la figura 2B, las posibles causas incluyen la coelución de un compuesto que interfiere, la sobrecarga de masa y el uso de un eluyente de muestra demasiado fuerte. Debido a que el problema se observó después de aumentar el volumen de inyección y las concentraciones de analito son bajas, la última causa parece ser la más probable. El eluyente de muestra utilizado para los cromatogramas que se muestran en las figuras 2A y 2B fue acetonitrilo/agua 50/50 v/v, elegido porque algunos de los analitos tienen una solubilidad limitada en agua. Dado que el gradiente comienza con una concentración de acetonitrilo de solo el 5 %, el eluyente de la muestra es considerablemente más fuerte que la fase móvil inicial. Debido a que los primeros analitos en eluir son los menos hidrófobos, se ven más afectados por el eluyente fuerte de la muestra. Para probar esta hipótesis, se preparó una serie de muestras con las mismas concentraciones de analito, pero con diferentes proporciones de acetonitrilo/agua. Los resultados del factor de asimetría para los dos primeros picos se muestran en la figura 3. Los factores de asimetría para ambos analitos disminuyen a medida que aumenta la concentración de acetonitrilo, lo que demuestra que el uso de un eluyente de muestra fuerte es la causa de la asimetría frontal de picos que se observan en la figura 2B. Para evitar este problema y garantizar que se disolvieran los analitos más hidrófobos, se eligió una concentración de acetonitrilo del 10 %. En la figura 2C se muestra el cromatograma resultante de la inyección de 4 µL de una muestra disuelta en acetonitrilo/agua 10/90 v/v. Ahora, todos los picos muestran el doble de la altura esperada en comparación con la inyección de 2 µL, con una buena simetría de los picos. Al optimizar el volumen de inyección, siempre se debe tener en cuenta la concentración del eluyente de la muestra en relación con la composición de la fase móvil inicial.
