Guía de iniciación a la SFC preparativa

Cribado de columna

Antes de poder aislar cromatográficamente un compuesto de interés, es necesario desarrollar un método. Esto se suele hacer en la escala analítica para ahorrar eluyente, tiempo y muestra. En SFC, no se puede predecir la retención de componentes individuales de una mezcla en una fase estacionaria definida. A diferencia de la RPLC, la identificación de la composición química correcta de la columna es fundamental para las separaciones por SFC y es el factor más importante en el desarrollo de métodos de SFC. Por lo tanto, es importante confiar en una estrategia de screening eficaz para maximizar la calidad de la separación con respecto a la del compuesto/s de interés de la purificación. El desarrollo de la fase estacionaria es actualmente muy dinámico y un pequeño número de composiciones químicas podrían surgir como columnas preferidas en el futuro. En la actualidad, la mayoría de los usuarios adaptan un proceso de screening automatizado utilizando las “mejores” columnas para su aplicación.

Es necesario tener en cuenta varios factores para determinar un conjunto adecuado de columnas para el screening. Es necesario mantener L/dp (longitud/tamaño de partícula) entre la columna analítica y la columna preparativa final, por lo que solo se deben considerar las columnas analíticas del tamaño adecuado. Esto asegura la continuidad de la cromatografía entre sistemas en escalado. Las columnas deben tener un amplio intervalo de selectividad y también ser adecuadas para la naturaleza de la muestra. Por ejemplo, es poco probable que los compuestos altamente polares (como los carbohidratos) se retengan en una columna C₁₈, mientras que una columna de sílice probablemente no sea óptima para compuestos extremadamente hidrofóbicos (no polares), como la mayoría de los carotenoides. Las columnas también se pueden clasificar según su idoneidad para compuestos básicos, ácidos o ambos.

Para la purificación quiral, se requieren columnas quirales. Debido a la interacción más compleja de la fase estacionaria con los compuestos de interés, se requiere más prueba y error para determinar la mejor columna para las separaciones quirales. Sin embargo, algunas columnas tienen una mayor tasa de éxito que otras. Por ejemplo, las fases quirales derivadas de la celulosa y la amilosa son populares por su amplia gama de aplicabilidad, mientras que otras fases quirales, como las fases de tipo Pirkle, son populares por su alta estabilidad química. Las fases quirales también se pueden utilizar con éxito para aplicaciones aquirales, especialmente con isómeros de posición o compuestos estrechamente relacionados.

El screening de columnas se realiza habitualmente en condiciones de gradiente de eluyente, habitualmente entre 2 % y 50 % de coeluyente. Estas condiciones dan al usuario una buena idea de qué columna será óptima para aislar el compuesto de interés, al tiempo que proporcionan una buena indicación de los porcentajes de coeluyentes necesarios para la elución del compuesto. La figura 14 es un ejemplo de screening de columnas quirales para la separación de (R) y (S) -goitrina (un producto natural activo que se encuentra en la raíz de Isatis Indigotica Fort), utilizando cinco fases estacionarias basadas en celulosa y amilosa (IC, OJ-H, AS -H, OD-H y AD-H), y una fase estacionaria de tipo Pirkle (S,S)-Whelk-O1. En la figura 15 se puede ver un ejemplo de screening de columnas aquirales, en el que se criba una mezcla de tres carotenoides en cuatro fases estacionarias aquirales. Tener en cuenta que los carotenoides se retienen mejor en el C₁₈ y no en las otras fases más polares.

Cribado del eluyente

El CO₂ por sí solo es generalmente insuficiente para eluir compuestos de una columna cromatográfica. Por ese motivo, se suele añadir un coeluyente polar. La selección del coeluyente es un parámetro clave en el desarrollo y optimización de métodos cromatográficos SFC. Para la mayoría de las aplicaciones, se puede utilizar una amplia gama de coeluyentes y mezclas para optimizar la separación. La gama de eluyentes compatibles en SFC puede parecer abrumadora; sin embargo, se puede simplificar emparejando ambos extremos del espectro de polaridad; CO₂ no polar con eluyentes orgánicos altamente polares, lo que da como resultado una fase móvil que cubre un amplio intervalo de fuerza elutrópica.

Los cuatro coeluyentes más utilizados son el metanol, el etanol, el isopropanol y el acetonitrilo; el metanol es el más fuerte y el acetonitrilo el más débil en polaridad. Por lo general, se recomienda metanol o etanol para el screening de columnas y el screening de eluyentes inicial. El isopropanol y el acetonitrilo son buenos para optimizar el método o en los casos en que el etanol o el metanol no dan como resultado una resolución aceptable. Muchas veces, las combinaciones de estos eluyentes pueden ajustar la polaridad de la fase móvil. Por ejemplo, la adición de acetonitrilo al etanol debilita el coeluyente, lo que aumenta la retención y proporciona una selectividad diferente. Por lo general, a medida que disminuye la fuerza del coeluyente, aumenta la retención. Además, al igual que en la LC, a medida que aumenta la proporción de eluyente fuerte, la retención disminuye (figura 16). A veces, sin embargo, debido a la baja viscosidad del CO₂, el caudal total se puede aumentar (al mismo porcentaje de coeluyente), lo que da como resultado un tiempo de análisis más rápido mientras se mantiene la separación (figura 17).

Aditivos en el coeluyente

Los picos más estrechos y la resolución mejorada son importantes en la cromatografía preparativa, donde los picos anchos y la baja solubilidad pueden tener resultados desastrosos para la productividad. La asimetría de picos en SFC se puede eliminar con el uso de aditivos en la parte de coeluyente de la fase móvil, lo que amplía el intervalo de solutos susceptibles de ser utilizados en una fase móvil basada en CO₂.

La utilización de CO₂ como eluyente cromatográfico produce una fase móvil ligeramente ácida cuando se combina con otros eluyentes orgánicos polares. Debido a que una fase móvil basada en CO₂ es ligeramente ácida, muchos compuestos ácidos y neutros muestran formas de pico aceptables sin la necesidad de un aditivo de fase móvil. Sin embargo, los aditivos ácidos pueden mejorar la forma de los picos de algunos compuestos ácidos (figura 18). Los aditivos ácidos comunes incluyen ácido trifluoroacético, ácido fórmico y ácido acético. Las aplicaciones que contienen compuestos básicos suelen requerir un aditivo básico (generalmente entre 0,1 y 1 %) para mejorar la cromatografía (figura 19). Los aditivos básicos comunes son aminas secundarias o terciarias, como isopropilamina (IPA), dietilamina (DEA) o trietilamina (TEA). Estos aditivos son extremadamente efectivos incluso en concentraciones muy bajas (tan bajas como 0,01 % en el coeluyente); sin embargo, pueden interferir con la detección de MS (espectrometría de masas) y presentar efectos de memoria en algunas composiciones químicas de la columna (específicamente en la sílice pura). Como resultado, también se utilizan acetato de amonio e hidróxido de amonio, ya que son más compatibles con la columna y la MS, e incluso pueden mejorar la detección por MS.

Además de los coeluyentes clásicos, muchas columnas nuevas son compatibles con coeluyentes o aditivos no clásicos, como acetato de etilo, tetrahidrofurano, diclorometano, cloroformo o dimetoximetano. Estas combinaciones permiten modular aún más los tiempos de retención y la selectividad, al tiempo que mejoran la solubilidad de la muestra. Un aditivo no clásico que está ganando popularidad es el agua. El agua es inmiscible con CO₂; sin embargo, cuando se utiliza como aditivo en un coeluyente fuertemente polar (como el metanol), el agua se convierte en una excelente opción para aumentar la solubilidad y la forma de los picos de los compuestos hidrofílicos en la SFC. La cantidad de agua que se puede tolerar depende de la proporción de coeluyente en la fase móvil total. Con el tiempo, se observará ruido de la línea base debido a la separación de fases (inmiscibilidad) en la fase móvil. Por lo general, se puede utilizar eficazmente del 1 % al 5 % de agua en el coeluyente polar. Con agua como aditivo, la SFC preparativa puede purificar compuestos más fuertemente polares.

Para fines de purificación, es mejor evitar el uso de aditivos que deberán eliminarse posteriormente. Si se necesitan aditivos para la separación, se deben utilizar aditivos volátiles que se puedan eliminar fácilmente en la concentración efectiva más baja. Alternativamente, ahora hay nuevas fases estacionarias que reducen la necesidad de aditivos por completo, lo que proporciona un beneficio significativo para la SFC preparativa.

La solubilidad y el factor de retención de todos los compuestos están estrechamente relacionados con la densidad del fluido.

La densidad de la fase móvil a lo largo de la columna es de gran importancia porque controla las propiedades físicas y químicas de la fase móvil. Una característica interesante de SFC es la capacidad de controlar la densidad de la fase móvil mediante la temperatura y la presión. Aunque la elección de la columna y la fase móvil es lo que más influye en la separación en SFC, la temperatura y la presión se utilizan para ajustar u optimizar una separación. Entre los dos parámetros, la presión tiene la mayor influencia en la cromatografía; a medida que aumenta la presión se incrementa la densidad, lo que suele reducir el tiempo de retención y la resolución (figura 20). Por otro lado, las temperaturas más altas dan como resultado una menor densidad y tiempos de retención más largos. Sin embargo, con la temperatura, el efecto depende del compuesto y puede dar lugar a un cambio en la resolución, o incluso al orden de elución para los compuestos que eluyen cerca; esto se ha observado con mayor frecuencia en las separaciones quirales (figura 21).

La presión se controla mediante un regulador de contrapresión (BPR, por sus siglas en inglés) que establece la “contrapresión” del sistema después de la columna. Aunque los sistemas están diseñados para una amplia gama de presiones (hasta puntos de ajuste de 400 bar), en la SFC preparativa, el regulador de contrapresión se establece normalmente entre 100 y 200 bar (entre 1450 y 2901 psi). Las temperaturas se controlan mediante puntos de ajuste, ya sea mediante un horno (calentando la columna) o intercambiadores de calor (calentando la fase móvil).

Los puntos de ajuste de temperatura habituales se encuentran entre 40 y 60 °C. Algunas aplicaciones se ejecutan en condiciones subcríticas (CO₂ líquido), en las que las temperaturas se establecen por debajo de los 25 °C y los 35 °C, mientras que la presión se mantiene relativamente alta. No se recomienda analizar a presiones y temperaturas cercanas al punto crítico, ya que en esas condiciones pequeños cambios de temperatura o presión producen grandes cambios en la densidad (y en la cromatografía). Las limitaciones tanto de temperatura como de presión suelen estar relacionadas con la solidez de la composición química o del relleno de la columna.

Optimización de las condiciones de la fase móvil

La elección de la combinación óptima de eluyente y columna suele ser específica de la aplicación o del objetivo. En un escenario perfecto, una alta carga, una buena resolución y una separación rápida se combinan para proporcionar una recuperación completa de la del compuesto de interés con una pureza elevada. En realidad, sin embargo, suele ser necesario hacer concesiones para determinar la solución más productiva. Por ejemplo, los picos pueden estar bien separados (lo que permite una carga elevada), pero requieren un tiempo de análisis más largo. Por otro lado, una buena separación con un tiempo de análisis significativamente más corto permitiría un tiempo de ciclo más rápido, pero posiblemente con una carga más baja. Otra consideración es el procesamiento posterior o la recuperación de fracciones, donde la cantidad o el tipo de eluyente puede ser un factor importante. Por último, si la separación se puede realizar en condiciones isocráticas, se pueden utilizar inyecciones apiladas, lo que mejora considerablemente la productividad. Una vez que se seleccionan una columna y un eluyente, se pueden manipular otros parámetros para optimizar mejor la separación antes del escalado y la purificación.

Optimización de las condiciones de gradiente: en SFC, los gradientes enfocados no funcionan igual que en RPLC. Debido a los muchos mecanismos de retención que compiten en la cromatografía en fase normal, los cambios en el gradiente pueden tener efectos dispares sobre la retención de diferentes analitos. En SFC, específicamente, también hay un cambio en la densidad y la caída de presión que acompaña al aumento del coeluyente a través del gradiente. A medida que aumenta la cantidad de coeluyente, el efecto sobre el tiempo de retención no es lineal, lo que dificulta predecir la selectividad de los compuestos con las condiciones cambiantes. Esto es un problema menor para compuestos estructuralmente similares, ya que siguen mecanismos de retención similares. Las muestras que contienen mezclas de compuestos que son estructuralmente diferentes (en una matriz, por ejemplo) presentan un desafío mayor. Sin embargo, en general, los gradientes más planos producen tiempos de retención más largos y una mejor resolución.

Determinación de las condiciones isocráticas: los métodos isocráticos son ideales porque son fáciles de desarrollar a partir de los resultados del screening y se pueden utilizar inyecciones apiladas, lo que mejora la productividad. Utilizando el tiempo de retención, la pendiente del gradiente del screening y compensando el retardo del volumen del sistema y de la columna, se pueden determinar los porcentajes de coeluyente en el momento de elución. En SFC, el mejor punto de partida para la optimización suele ser un 5 % por debajo del porcentaje calculado.

El gradiente del screening fue del 2 al 20 % durante 5 minutos y el retardo del gradiente fue de 0,46 min (determinado previamente). Por lo tanto, con una pendiente calculada de 3,6 %/min y un porcentaje inicial del 2 %, el porcentaje de coeluyente en el momento de elución del primer pico a los 4,12 minutos se calculó utilizando la siguiente ecuación:

■ % de coeluyente en la elución = (tiempo de retención – retardo del gradiente) × pendiente del gradiente +% inicial

■ % de coeluyente en elución = (4,12 min – 0,46 min) × 3,6 % / min + 2 %

■ % de coeluyente en elución = 15 %

Por lo tanto, después de restar el 5 %, se utilizaron condiciones de coeluyente isocrático al 10 % como punto de partida para la optimización. La cromatografía resultante mostró una buena separación; pero al aumentar de nuevo la fracción de coeluyente de la fase móvil al 15 %, los picos seguían estando bien resueltos con un tiempo de análisis más corto. En este caso, el método del 10 % permitiría una carga más alta, mientras que el método del 15 % permitiría tiempos de ciclo más rápidos.

Escala del sistema

Para la SFC preparativa, se dispone de instrumentos con capacidad para funcionar a caudales de 2 mL/min a varios cientos de mL/min para cumplir con los requisitos necesarios para trabajar en diversas escalas. En un flujo de trabajo adecuado, la escala de la purificación debe coincidir con el objetivo de la aplicación. Esto es particularmente importante cuando la muestra es limitada o tiene baja solubilidad. En esa situación, es más práctico un sistema de purificación a menor escala (semipreparativo). En SFC, las purificaciones a pequeña escala se suelen realizar en columnas con un diámetro interno de 4,6 mm a 10 mm, a caudales de 3 a 20 mL/min. A continuación se muestra una tabla que compara el tamaño de la columna con los caudales y la capacidad de carga aproximada en SFC preparativa (tabla 5). Es importante tener en cuenta que la capacidad de carga de una muestra en particular depende de muchos factores, incluida la solubilidad, la resolución de la del compuesto de interés y la cantidad relativa del compuesto de interés en la matriz.

Los sistemas SFC preparativa a mayor escala utilizan columnas de 18 a 50 mm de diámetro interno a caudales de 50 a 350 mL/min. La mayor capacidad de la columna permite una mayor carga por inyección y mayores caudales, lo que optimiza el rendimiento para esas aplicaciones. En el mundo global de la purificación, estos sistemas se consideran de escala media. Los grandes sistemas SFC preparativa a escala piloto (que no se tratan aquí) se utilizan en muchos procesos industriales establecidos. Estos sistemas utilizan columnas cromatográficas de compresión axial dinámica (DAC, por sus siglas en inglés) de alta presión muy grandes (de 30 cm de diámetro interno o más) y suelen utilizarse como instalaciones de planta.

Flujos de trabajo: a granel (“Bulk”) o por lotes (“Batch”)

Dependiendo de la aplicación, hay dos flujos de trabajo básicos que se utilizan en SFC preparativa. La primera se denomina purificación “Bulk” (A granel). En este flujo de trabajo, se inyecta una sola muestra de gran cantidad varias veces hasta que se recupera la cantidad requerida de la del compuesto/s de interés o se agota la muestra. Todas las fracciones recogidas coincidentes se agrupan en una de un número limitado de recipientes de recogida. Se procesan y recuperan cantidades “a granel” de material en el transcurso de varias horas (o incluso días). Normalmente, se trata de una purificación dirigida por UV, aunque se pueden utilizar otros métodos de detección. En este caso, las muestras suelen ser conocidas y estar bien caracterizadas, y el objetivo es una alta productividad.

Para muchas aplicaciones “a granel”, se utilizan inyecciones apiladas. Las inyecciones apiladas mejoran significativamente el rendimiento al utilizar todo el espacio cromatográfico disponible para la separación y purificación continuas. Básicamente, las inyecciones apiladas reducen el tiempo entre los ciclos de inyección y minimizan aún más el uso de eluyentes. En la figura 22, se puede ver un ejemplo de inyecciones apiladas. En algunas aplicaciones, se pueden realizar varias inyecciones antes de que haya eluido el primer conjunto de picos. Para que se utilicen inyecciones apiladas, el sistema debe poder inyectar mientras se realizan las recogidas. Por tanto, se utiliza un módulo de inyección independiente o un sistema capaz de mover de forma autónoma los conjuntos de recogida e inyección (agujas y sondas).

La purificación “Batch” (Por lotes) se refiere a un flujo de trabajo que resulta más práctico para la purificación de la biblioteca o cuando hay varias muestras con varias dianas que deben purificarse. Por lo general, se utiliza la purificación dirigida por masas porque es más selectiva al recoger fracciones. Con la purificación dirigida por óptica (o UV), el detector no puede distinguir los picos entre sí. Muchos compuestos absorben a la misma longitud de onda. La purificación dirigida por masas recoge fracciones en función de la masa, que es un parámetro mucho más específico porque distingue entre el compuesto/s de interés y las impurezas. Esto es especialmente útil cuando las muestras tienen matrices complejas, no están bien caracterizadas o no pueden detectarse por UV porque no tienen cromóforos. Normalmente, los métodos de gradiente se utilizan para mejorar la forma de los picos y separar mejor los compuestos de las interferencias complejas. Este flujo de trabajo utiliza la recogida en lecho abierto en varios tubos; normalmente cada tubo constituye una sola fracción. Las muestras se analizan como un “lote” y los compuestos de interés se recogen en función de sus masas. La purificación por lotes también se puede realizar utilizando solo UV o activadores UV y MS. En la figura 23, se puede ver un ejemplo de purificación basada en MS de compuestos de interés a partir de productos naturales.