La tecnología líquida supercrítica (SFx) es el concepto subyacente detrás de la purificación basada en la SFC. Las técnicas de SFx de Waters incluyen extracción (SFE), cromatografía analítica (UPC²) y cromatografía preparativa (Prep SFC); todas ellas utilizan CO₂ subcrítico o supercrítico como eluyente principal. Al sustituir los eluyentes orgánicos líquidos y acuosos por CO₂, la tecnología SFx proporciona una alternativa ortogonal, respetuosa con el medioambiente y más rentable que la purificación basada en líquidos. SFx se considera tecnología “verde” porque tiene una huella medioambiental reducida debido a la ausencia de residuos de eluyentes orgánicos. En comparación con la purificación por LC, esta tecnología proporciona mejoras en la velocidad y la selectividad, lo que significa que el tiempo y el coste necesarios para pasar de un material de partida complejo a un producto final se reducen considerablemente. Con los avances recientes en la tecnología de instrumentos, el poder de separación de las técnicas de SFx se está aprovechando por completo para una amplia gama de aplicaciones de purificación.

Muchas sustancias requieren condiciones extremas para alcanzar su estado supercrítico y muestran propiedades indeseables cuando se encuentran en ese estado. En la tabla 1, se muestran las condiciones de los fluidos supercríticos y las propiedades asociadas de algunas sustancias supercríticas seleccionadas. A diferencia de otras sustancias supercríticas, el CO₂ se considera seguro en general porque no es inflamable, explosivo, tóxico ni corrosivo. Debido a que el estado supercrítico del CO₂ se puede alcanzar fácilmente, a 31 °C y 74 bar, la densidad se puede manipular a temperaturas y presiones dentro de un intervalo aceptable. Además, debido a la temperatura crítica relativamente suave, es adecuado para muestras térmicamente lábiles. El CO₂ también es relativamente barato porque se recupera fácilmente de otros procesos industriales; esto significa que tiene un impacto neutro en los niveles de CO₂ ambientales. Todas estas ventajas hacen del CO₂ la sustancia más utilizada en las tecnologías líquida supercrítica.

Un flujo de trabajo de purificación consta de varios pasos, cuya complejidad y necesidad varían en función de los requisitos de la aplicación. Básicamente, un flujo de trabajo de purificación de SFx contiene los siguientes componentes.

Material de partida o muestra: la muestra puede ser compleja, como en un producto botánico natural, o relativamente simple, como un candidato farmacéutico bien caracterizado. Esto determinará la cantidad de preparación de muestra requerida, si es necesario, y la escala de purificación. También es bueno tener la mayor cantidad de información posible sobre la muestra y el producto final, como la estabilidad térmica, la polaridad, la solubilidad y la reactividad, lo que determina cómo se puede tratar esa muestra.

Preparación de la muestra: en el primer paso del proceso de purificación, la muestra debe prepararse adecuadamente en función del estado del material de partida y del objetivo o alcance de la aplicación. La preparación de las muestras puede tener muchos pasos, como triturar, secar, extraer y filtrar, o simplemente disolver la muestra en una solución. La extracción con fluidos supercríticos (SFE) es el primer paso (preparación de la muestra) en un flujo de trabajo SFx. Por lo general, se utiliza en aplicaciones que involucran productos industriales crudos, biobotánicos o productos naturales.

Purificación de la muestra: la purificación se utiliza para disminuir la complejidad de la muestra o aislar un producto final dentro de una determinada especificación de pureza para el análisis o la formulación del producto. Las muestras preparadas por SFE suelen ser mezclas complejas que contienen los compuestos de interés e impurezas. En un flujo de trabajo SFx, la cromatografía líquida supercrítica preparativa (Prep SFC) es el segundo paso (purificación), en el que se purifican uno o varios objetivos a partir de un extracto. La Prep SFC también se puede aplicar a muestras preparadas utilizando muchos métodos diferentes, no solo por SFE.

Producto final: el producto final es el objetivo final del flujo de trabajo. Pueden ser datos e información generados por análisis, un material refinado utilizado en un proceso o un producto final que se puede utilizar directamente. El producto final dicta la instrumentación y la metodología necesarias para un flujo de trabajo satisfactorio. En un flujo de trabajo SFx, el análisis de las muestras antes y después de la extracción (SFE) y la purificación (Prep SFC) se realiza mediante cromatografía de convergencia de ultrarrendimiento, UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC²).

Cualquiera de estas tecnologías SFx se puede utilizar, según sea necesario, en flujos de trabajo no SFx, como pasos de preparación, purificación o análisis.

La cromatografía líquida preparativa de alta resolución (Prep HPLC) ha sido una de las técnicas de purificación más utilizadas durante más de 20 años. En concreto, es un proceso de separación popular en las industrias de química fina, farmacéutica y biotecnología, donde se utiliza ampliamente para la purificación de productos. Durante este tiempo, la Prep HPLC se ha convertido en una técnica muy eficaz y aplicable, especialmente para la purificación aquiral. La cromatografía líquida en fase reversa (RPLC) tiene la ventaja de utilizar una fase estacionaria cuasi universal (C₁₈) y una mezcla de fase móvil de agua y acetonitrilo, de aplicación general. La RPLC es compatible con la espectrometría de masas (MS) y la RPLC emparejada con MS (RPLC-MS) ha sido el enfoque estándar para la purificación en muchos entornos de investigación.

A pesar de su popularidad, la Prep HPLC tiene varios inconvenientes. El volumen de fase móvil necesario para purificar una masa determinada de compuesto es grande en comparación con la cantidad total de muestra que se procesa. Las fracciones típicas de la Prep HPLC contienen grandes volúmenes de eluyente (tanto orgánico como acuoso), lo que crea un cuello de botella en la productividad debido al tiempo y la energía necesarios para secar y obtener el producto final.

Los eluyentes utilizados en la LC pueden contaminar el medioambiente, tanto localmente (por evaporación y exposición) como en general debido a la quema de residuos químicos. La cromatografía líquida en fase normal (NPLC) se considera incluso más perjudicial para el medioambiente, ya que la fase móvil suele estar compuesta por un 100 % de eluyente orgánico. Debido a estos factores ambientales, la adquisición y eliminación de los eluyentes utilizados en la LC es cada vez más costosa; esto crea un incentivo para procesos más ecológicos o sin eluyentes. La SFC es una técnica alternativa que puede ayudar a aliviar el cuello de botella y producir mejoras operativas que acortan los plazos, reducen el desperdicio de eluyentes y reducen los costes. Recientemente, el progreso en la instrumentación de SFC ha generado un interés renovado en la técnica como una herramienta poderosa para la purificación quiral y aquiral. SFC es una alternativa ambientalmente más “ecológica” a la HPLC para análisis y purificación.

La cromatografía líquida supercrítica (SFC) es una técnica cromatográfica que utiliza CO₂ subcrítico (líquido) y supercrítico como eluyente principal en la fase móvil, generalmente acompañado de un eluyente orgánico. Como toda cromatografía, la SFC separa los componentes basándose en la partición de los analitos entre una fase estacionaria (columna) y una fase móvil (eluyente). Hay muchas similitudes entre la HPLC y la SFC, por ejemplo: la SFC se puede ejecutar utilizando condiciones de método tanto isocráticas como en gradiente y es compatible con todas las técnicas de detección estándar, como ultravioleta (UV), matriz de fotodiodos (PDA), light scattering evaporativo (ELS) y espectrometría de masas (MS). El flujo de trabajo general de la Prep SFC es el mismo que para la HPLC, que implica el desarrollo de métodos, el escalado, la recolección de fracciones y el análisis de pureza de las fracciones recogidas (figura 3). También es comparable a la RPLC en términos de recuperación y pureza; para algunas aplicaciones, la recuperación es mejor en SFC, mientras que para otras HPLC es la mejor solución.

La SFC generalmente aprovecha los principios de la cromatografía en fase normal. Lo que diferencia a la SFC de la HPLC es el uso de CO₂ como componente principal de la fase móvil; sustituyendo componentes líquidos no polares, como hexanos y heptanos. Debido a que el CO₂ supercrítico es un fluido compresible, la presión y la temperatura se convierten en parámetros importantes que se utilizan para controlar la fuerza del eluyente, lo que afecta la retención y la selectividad. El CO₂ supercrítico es favorable para la purificación cromatográfica porque no es inflamable, no es tóxico y tiene alta difusividad, baja viscosidad y excelente poder de solvatación. La SFC se ha vuelto atractiva para los laboratorios de purificación en los últimos años, al proporcionar importantes ventajas en términos de ahorro de eluyentes y productividad.

Una de las principales ventajas de la Prep SFC es el menor uso de eluyentes que se logra al sustituir la mayor parte de la fase móvil con CO₂. A escala analítica, esta ventaja puede ser pequeña, pero en la escala preparativa la ventaja es bastante significativa. En muchos laboratorios de purificación, se puede dedicar una cantidad significativa de tiempo a la eliminación de eluyentes de las fracciones recogidas, lo que crea un cuello de botella entre la purificación de un compuesto y la obtención del producto de interés o resultado deseado. En la Prep SFC, la parte de CO₂ de la fase móvil se elimina durante la despresurización, dejando solo una pequeña cantidad de coeluyente. Las fracciones resultantes tienen concentraciones de producto más altas, lo que reduce el tiempo necesario para la eliminación del eluyente y el aislamiento del producto. La fracción también se puede analizar directamente sin necesidad de pasos de concentración o enriquecimiento de la muestra. Esto es de particular importancia para los compuestos que se descomponen rápidamente en condiciones normales de secado prolongado.

Otras ventajas del menor uso de eluyentes orgánicos en la SFC son el ahorro de costes, la seguridad con respecto a la inflamabilidad y la toxicidad, y la reducción del impacto en el medioambiente. Hay una considerable ventaja de costes en términos de adquisición y eliminación del eluyente; sin embargo, también hay ahorros debido al menor consumo de energía necesario para la eliminación de los eluyentes. La SFC también puede evitar el uso de eluyentes tóxicos como el acetonitrilo utilizado en RPLC y los hidrocarburos alifáticos y eluyentes clorados utilizados en NPLC. El CO₂ como eluyente es relativamente económico porque es un subproducto procedente de otros procesos industriales y es reciclable.

Ventajas de Prep SFC: mayor productividad

En la SFC, la productividad aumenta debido a la baja viscosidad y la alta difusividad de la fase móvil, lo que mejora la velocidad y la eficacia cromatográficas. La figura 4 muestra una comparación de las curvas de Van Deemter de HPLC, UPLC, SFC y UPC². En cromatografía, la velocidad de las separaciones depende en parte de la rapidez con la que el soluto se difunde en la fase móvil y entra y sale de la fase estacionaria. Las curvas de Van Deemter para SFC son más amplias y planas que para HPLC, lo que indica que la eficacia de la cromatografía sigue siendo alta (valores de altura de plato bajos) a medida que aumenta el caudal (velocidad lineal). En la SFC, los coeficientes de difusión más altos se traducen directamente en una cromatografía de mayor velocidad.

Debido a la menor viscosidad de la fase móvil, las presiones de la columna y del sistema son más bajas, lo que permite utilizar velocidades lineales de hasta 3 a 4 veces más rápidas que las observadas en la HPLC, y el uso de columnas de tamaño de partícula más pequeño. La baja viscosidad también reduce los tiempos de equilibrado. El resultado son tiempos de análisis cortos con una alta eficacia de separación, lo que aumenta la capacidad de carga y reduce el tiempo del ciclo de inyección; parámetros clave para mejorar la productividad en cualquier proceso de cromatografía preparativa. Por lo tanto, los compuestos puros se pueden generar en un período de tiempo más corto, lo que da como resultado una mayor productividad general. En la tabla 2 se puede ver un ejemplo del ahorro de tiempo y productividad entre HPLC y SFC.

La relación ortogonal entre SFC y RPLC ofrece la oportunidad de mejorar la calidad del producto en muchas aplicaciones. La RPLC aplica la columna C₁₈ como una solución casi universal, lo que simplifica en gran medida el desarrollo de métodos, pero la fase móvil acuosa limita el intervalo de compatibilidad de los eluyentes y la solubilidad del compuesto. La SFC, por otro lado, funciona bien con una amplia gama de diluyentes orgánicos, lo que da como resultado una gama más amplia de compatibilidad con los eluyentes y compuestos. También tiene una amplia gama de fases estacionarias para elegir.

La SFC es ortogonal a la RPLC porque generalmente se considera una cromatografía de fase normal y proporciona una diversidad de opciones de separación en un formato cromatográfico fácil de usar. En particular, al combinar la selectividad de fase normal con una alta eficacia de separación, la SFC resulta ventajosa al separar estereoisómeros, isómeros posicionales y compuestos estructuralmente similares. Para compuestos no polares, la flexibilidad de la SFC permite el uso de columnas de fase reversa (como C₁₈), mientras que la adición de agua como aditivo extiende el intervalo de aplicación a la región más polar. En aquellas aplicaciones en las que los compuestos se degradan fácilmente, la purificación por SFC es una alternativa ideal porque las separaciones se realizan rápidamente, sin agua, y el secado de las fracciones se completa a bajas temperaturas y en menos tiempo.

La Prep SFC es comparable a RPLC en términos de recuperación y pureza, y hay una superposición en las aplicaciones que pueden realizarse tanto con SFC como con RPLC. La figura 5 muestra los resultados de un estudio en el que se seleccionó una biblioteca farmacéutica de compuestos para la purificación mediante SFC y LC. Aproximadamente el 82 % de los compuestos podrían purificarse mediante cualquiera de las dos técnicas. Sin embargo, el estudio también muestra cómo las dos plataformas son complementarias. Algunos compuestos solo pudieron purificarse por SFC (4 %), mientras que otros solo pudieron purificarse por LC (8 %). La flexibilidad que ofrece el emparejamiento de las dos plataformas ofrece una mayor oportunidad para optimizar la separación y la purificación. La SFC proporciona una selectividad complementaria a la de RPLC, lo que permite un enfoque ortogonal en el desarrollo de métodos y la separación de muestras complejas difíciles. Al realizar una purificación en varios pasos a través de plataformas o al utilizar una técnica ortogonal para el análisis de fracciones, se puede recuperar un producto más puro y obtener más información. En la figura 6 se muestra un ejemplo de purificación de un compuesto a partir de una matriz compleja mediante separaciones ortogonales por LC y SFC.