Guía de iniciación a SPE

SPE es cromatografía

No olvide que la extracción en fase sólida se basa en los mismos principios que la HPLC. Cualquier tipo de información sobre el comportamiento cromatográfico de los analitos de interés, y de otros componentes de la matriz, puede ayudar a la hora de elegir el sorbente y los eluyentes adecuados. Por ejemplo, si se sabe que determinadas condiciones cromatográficas proporcionan una excelente separación del analito de las interferencias, se puede elegir una combinación similar de sorbente y eluyente para la SPE. Del mismo modo, si se intenta eliminar una interferencia que coeluye en HPLC, a priori unas condiciones de SPE similares no tendrán éxito.

Protocolos generales de elución

Hay dos estrategias generales para aislar y limpiar los componentes de interés de la muestra:

• Adsorber las interferencias de la matriz mientras los componentes de interés atraviesan el cartucho sin ser retenidos.
• Adsorber los componentes de interés mientras las interferencias de la matriz atraviesan el cartucho sin ser retenidas.

La primera estrategia se suele elegir cuando el componente de muestra deseado está presente en una alta concentración. Cuando hay componentes de interés presentes a bajos niveles, o bien es necesario aislar varios componentes con polaridades muy diferentes, por lo general, se emplea la segunda estrategia. Con la segunda estrategia también se logra el enriquecimiento de trazas de compuestos presentes a niveles extremadamente bajos y la concentración de muestras diluidas.

Pasos de un procedimiento de extracción en fase sólida

En la siguiente sección se describen los pasos en que consiste un procedimiento de extracción en fase sólida completo. En muchas aplicaciones, se pueden omitir uno o más de los pasos que se enumeran a continuación, y que se describen posteriormente mediante ejemplos generales, lo que simplifica el procedimiento. Los procedimientos ilustrados aquí utilizan muestras que contienen colorantes a fin de que las separaciones se puedan visualizar con facilidad. Se debe tener en cuenta que la mayoría de las muestras contienen componentes incoloros que precisan de algún tipo de detector o prueba para identificarlos en las fracciones obtenidas. La siguiente información se debe usar como orientación para el desarrollo de un procedimiento propio o cuando se modifiquen los procedimientos publicados en la bibliografía.

1. Tratamiento previo de la muestra
2. Acondicionamiento del cartucho
3. Carga de la muestra
4. Elución de las fracciones

Cromatografía de fase normal

Este modo se utiliza habitualmente para separar compuestos orgánicos neutros cuya naturaleza química oscila entre hidrofóbica y moderadamente polar.

Para llevar a cabo una cromatografía en fase normal con cartuchos de SPE, se debe utilizar un gradiente escalonado de eluyentes no polares con un material de relleno polar.

1. Acondicionar el cartucho con 6-10 volúmenes de retención de eluyente no polar, generalmente el mismo eluyente en el que se disuelve la muestra.
2. Cargar la solución de muestra en el lecho del cartucho.
3. Eluir los componentes no deseados con un eluyente no polar.
4. Eluir el primer componente de interés con un eluyente más polar.
5. Eluir los componentes de interés restantes con eluyentes progresivamente más polares [más fuertes].
6. Una vez recuperados todos los componentes, deseche el cartucho usado de forma segura y adecuada.

Este procedimiento se ilustra en la siguiente figura para una muestra que contiene una mezcla de tres colorantes orgánicos neutros relativamente no polares (amarillo, rojo y azul), que parece de color negro cuando se carga inicialmente en el lecho del cartucho.

Ilustración de un protocolo de elución general para cromatografía de fase normal en cartuchos de SPE
(sílice, Florisil, alúmina, diol, CN, NH₂)

Cromatografía de fase reversa

Debido a la multiplicidad de muestras acuosas que abarcan una amplia gama de aplicaciones, desde agua medioambiental hasta frutas y verduras, desde bebidas hasta fluidos biológicos, la cromatografía de fase reversa se ha convertido en el modo predominante de SPE.

Para llevar a cabo una cromatografía de fase reversa con cartuchos de SPE, utilice un gradiente de eluyentes de fuertemente polares a débilmente polares (fuerza de elución de eluyente de débil a fuerte) con un material de relleno no polar.

1. Solvatar la fase enlazada a la base de sílice o el relleno polimérico con seis a diez volúmenes de retención de metanol o acetonitrilo. Enjuague el cartucho con 6-10 volúmenes de retención de agua o solución tampón. No permita que el cartucho se seque (a menos que se utilice HLB).
2. Cargar la muestra disuelta en un eluyente (débil) fuertemente polar (normalmente agua).
3. Eluya los componentes no deseados con un eluyente fuertemente polar.
4. Eluya los componentes de interés débilmente retenidos con un eluyente menos polar.
5. Eluir los componentes más enlazados con eluyentes cada vez más apolares (más fuertes).
6. Una vez recuperados todos los componentes de interés, deseche el cartucho usado de forma segura y adecuada.

Este procedimiento se ilustra en la siguiente figura para una muestra de una bebida de uva acuosa que contiene dos colorantes alimentarios polares (rojo y azul), así como azúcar y aroma artificial (¡pero no zumo de uva real!). Tal como se prepara, esta bebida parece de color morado claro en un vaso, ya que la concentración de colorante está diluida. Cuando se carga una parte en un cartucho de SPE preparado, los colorantes fuertemente retenidos se concentran cerca de la entrada en una banda de color violeta oscuro.

Ilustración de un protocolo de elución general para cromatografía de fase reversa en cartuchos de SPE
(C₁₈, tC₁₈, C₈, CN, Diol, HLB, Porapak RDX, NH₂)

Cromatografía de intercambio iónico

Los compuestos iónicos o ionizables suelen aislarse mejor utilizando alguna forma de cromatografía de intercambio iónico. Este modo de separación es ortogonal para los modos de fase normal y fase reversa más utilizados, y proporciona una segunda dimensión selectiva y potente para los protocolos de preparación de muestras.

Ilustración de los dos tipos principales de fases (intercambio aniónico y catiónico)
y cómo atraen y retienen selectivamente las moléculas de carga opuesta

Para llevar a cabo una cromatografía de intercambio iónico con cartuchos de SPE, utilice un gradiente de pH o fuerza iónica con un material de relleno de intercambio iónico.

1. Acondicione el cartucho con 6-10 volúmenes de retención de agua desionizada o solución tampón débil.
2. Cargue la muestra disuelta en una solución de agua desionizada o solución tampón.
3. Eluya los componentes no deseados y débilmente unidos con una solución tampón débil.
4. Eluya el primer componente de interés con una solución tampón más fuerte (cambiar el pH o la fuerza iónica).
5. Eluya otros componentes con soluciones tampón cada vez más fuertes.
6. Una vez recuperados todos los componentes, deseche el cartucho usado de forma adecuada.

Este procedimiento se ilustra en la siguiente figura para una muestra de una mezcla acuosa de dos colorantes iónicos con diferentes valores de pK_a. Cuando se cargan en el cartucho, ambos quedan fuertemente retenidos y la combinación de los componentes azul y amarillo aparece como una banda verde cerca de la entrada.

Ilustración del protocolo de elución general para cromatografía de intercambio iónico en cartuchos de SPE
(NH₂, Accell™ Plus QMA, Accell Plus CM, SCX, SAX, WCX, WAX)

Los intercambiadores de cationes y aniones se clasifican además como intercambiadores débiles o fuertes, en función del tipo de grupo iónico en su superficie. Los intercambiadores de cationes fuertes poseen una parte superficial ácida, como ácido sulfónico, que siempre está ionizada (cargada negativamente) en todo el intervalo de pH. Los intercambiadores de cationes débiles poseen una parte superficial ácida, como ácido carboxílico, que está cargada negativamente a pH alto, pero está neutra a pH bajo. De manera similar, los intercambiadores de aniones fuertes suelen tener grupos de amonio cuaternario que siempre están cargados positivamente; mientras que los intercambiadores de aniones débiles poseen grupos amino primarios, secundarios o terciarios que pueden tener carga positiva a pH bajo, pero neutra a pH alto.

Utilizar la siguiente tabla como guía para elegir el tipo de cartucho de intercambio iónico de SPE adecuado para el analito en particular.

La cromatografía de intercambio iónico en modo mixto combina el uso de los modos de fase reversa e intercambio iónico en un único protocolo y en el mismo cartucho de SPE. Se puede utilizar para aislar y separar compuestos neutros, ácidos y básicos de una única matriz compleja. Un sustrato sorbente de SPE en modo mixto ideal sigue siendo humectable con agua mientras exhibe una fuerte retención de fase reversa de compuestos hidrofóbicos. En su superficie hay grupos funcionales de intercambio iónico de uno de los cuatro tipos generales que se acaban de describir. Se pueden utilizar lavados intermedios con mezclas de eluyentes orgánicos con una fuerza de elución adecuada para aislar los compuestos neutros (incluidos los analitos ionizables en su estado neutro). La elución selectiva de analitos enlazados iónicamente se puede lograr manipulando la carga del analito (cuando está unido a los intercambiadores de iones fuertes) o del sorbente (para los analitos unidos a los intercambiadores de iones débiles).