Guía de iniciación a la cromatografía líquida

El tubo de la columna y los conectores deben contener el material de relleno cromatográfico [fase estacionaria] que se utiliza para realizar la separación. Debe soportar la contrapresión creada tanto durante la fabricación como durante el uso. Además, debe proporcionar una trayectoria de flujo bien controlada [sin fugas, con un volumen mínimo y sin volumen muerto] para la muestra en su entrada y las bandas de analito en su salida, y ser químicamente inerte en relación con el sistema de cromatografía [fases de muestra, móvil y estacionaria]. La mayoría de las columnas están fabricadas con acero inoxidable para ofrecer la máxima resistencia a la presión. El PEEK [un plástico diseñado mediante ingeniería] y el vidrio, aunque son menos tolerantes a la presión, se pueden utilizar cuando se requieren superficies inertes para aplicaciones químicas o biológicas especiales. [Figura M-1].

Una pared de columna de vidrio ofrece una ventaja visual. En la foto de la figura M-2, el flujo se ha detenido mientras las bandas de muestra aún están en la columna. Se puede ver que los tres colorantes de la combinación de muestras inyectada ya se han separado en el lecho; el analito amarillo, que viaja más rápido, está a punto de salir de la columna.

Rendimiento de la separación – Resolución

El grado en el que se separan dos compuestos se denomina resolución cromatográfica [RS]. Los dos factores principales que determinan la resolución o el poder de separación total que se puede lograr con una columna de HPLC son: el poder de separación mecánica, creado por la longitud de la columna, el tamaño de la partícula y la uniformidad del lecho rellenado, y el poder de separación químico, creado por la competencia fisicoquímica para compuestos entre el material de relleno y la fase móvil. La eficacia es una medida del poder de separación mecánica, mientras que la selectividad es una medida del poder de separación química.

Potencia de separación mecánica – Eficacia

Si el lecho de una columna es estable y está relleno de manera uniforme, su capacidad de separación mecánica está determinada por la longitud de la columna y el tamaño de las partículas. La potencia de separación mecánica, también llamada eficacia, a menudo se mide y se compara mediante un número de placa [símbolo = N]. Los lechos cromatográficos de partículas más pequeñas tienen mayor eficacia y mayor contrapresión. Para un tamaño de partícula determinado, se obtiene más poder de separación mecánica aumentando la longitud de la columna. Sin embargo, las compensaciones son tiempos de análisis cromatográficos más largos, con mayor consumo de eluyente y mayor contrapresión. Las longitudes de columna más cortas minimizan todas estas variables pero también reducen la potencia de separación mecánica, como se muestra en la figura N.

Para una determinada composición química de partículas, fase móvil y caudal, como se muestra en la figura O, una columna de la misma longitud y diámetro interno, pero con un tamaño de partícula más pequeño, proporcionará más poder de separación mecánica al mismo tiempo. Sin embargo, su contrapresión será mucho mayor.

Potencia de separación química – Selectividad

La elección de una combinación de la composición química de las partículas [fase estacionaria] y la composición de la fase móvil (el sistema de cromatografía) determinará el grado de poder de separación química [cómo se cambia la velocidad de cada analito]. Optimizar la selectividad es el medio más eficaz para crear una separación; esto puede obviar la necesidad de aplicar la fuerza bruta con la mayor eficacia mecánica posible. Para crear una separación de dos compuestos especificados, un científico puede elegir entre una multiplicidad de combinaciones de fases [fase estacionaria y fase móvil] y mecanismos de retención [modos de cromatografía]. Estos se analizan en la siguiente sección.