Guía de iniciación a la cromatografía líquida

Alúmina

Forma porosa y en partículas de óxido de aluminio [Al₂0₃] que se utiliza como fase estacionaria en la cromatografía de adsorción en fase normal. La alúmina tiene una superficie básica muy activa; el pH de una suspensión acuosa al 10 % es de aproximadamente 10. Se lava sucesivamente con ácido fuerte para obtener grados neutros y ácidos [pH de la suspensión de 7,5 y 4, respectivamente]. La alúmina es más higroscópica que la sílice. Su actividad se mide según la escala de Brockmann † para el contenido de agua; p. ej., el grado de actividad I contiene 1 % de H₂O.

† H. Brockmann y H. Schodder, Ber. 74: 73 (1941).

Línea base*

La parte del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando solo sale la fase móvil de la columna.

Cartucho

Tipo de columna, sin conectores terminales, que consta simplemente de un tubo abierto en el que el material de relleno está retenido por un fritado en cada extremo. Los cartuchos de SPE se pueden utilizar en paralelo en un colector de vacío. Los cartuchos de HPLC se colocan en un soporte de cartucho que tiene conexiones de fluidos integradas en cada extremo. Las columnas de cartucho son fáciles de cambiar, más baratas y más prácticas que las columnas convencionales con conectores terminales integrados.

Cromatograma*

Una representación gráfica o de otro tipo de la respuesta del detector u otra cantidad utilizada como medida de la concentración del analito en el efluente frente al volumen o tiempo del efluente. En la cromatografía plana [p. ej., cromatografía en capa fina o cromatografía en papel], el cromatograma puede hacer referencia al papel o la capa que contiene las zonas separadas.

Cromatografía*

Método fisicoquímico dinámico de separación en el que los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria [la fase estacionaria] mientras que la otra [la fase móvil] se mueve con respecto a la fase estacionaria.

Volumen de la columna* [Vc]

El volumen geométrico de la parte del tubo que contiene el relleno [área de la sección transversal interna del tubo multiplicada por la longitud del lecho de relleno, L]. El volumen entre partículas de la columna, también llamado volumen intersticial, es el volumen ocupado por la fase móvil entre las partículas del lecho de relleno. El volumen vacío [V₀] es el volumen total ocupado por la fase móvil, es decir, la suma del volumen intersticial y el volumen intrapartícula [también llamado volumen de poros].

Detector * [consultar Sensibilidad]

Dispositivo que indica un cambio en la composición del eluyente mediante la medición de propiedades físicas o químicas [p. ej., absorbancia de luz UV/visible, índice de refracción diferencial, fluorescencia o conductividad]. Si la respuesta del detector es lineal con respecto a la concentración de la muestra, se puede cuantificar la cantidad de un componente mediante una calibración adecuada con patrones. A menudo, puede ser beneficioso utilizar dos tipos diferentes de detectores en serie. De esta manera, se puede obtener información más corroborativa o específica sobre los analitos de la muestra. Algunos detectores [p.ej., electroquímicos, espectrométricos de masas] son destructivos; es decir, producen un cambio químico en los componentes de la muestra. Si un detector de este tipo se combina con un detector no destructivo, normalmente se coloca en segundo lugar en la trayectoria del flujo.

Pantalla

Dispositivo que registra la respuesta eléctrica de un detector en la pantalla de un ordenador en forma de cromatograma. Los sistemas avanzados de registro de datos también realizan cálculos utilizando algoritmos sofisticados, p. ej., para integrar áreas de picos, restar líneas base, igualar espectros, cuantificar componentes e identificar incógnitas mediante la comparación con bibliotecas estándar.

Eficacia [H, consultar Número de platos, Resolución, Sensibilidad, Velocidad]

Medida de la capacidad de una columna para resistir la dispersión de una banda de muestra a medida que atraviesa el lecho de relleno. Una columna eficiente minimiza la dispersión de banda o el ensanchamiento de banda. Una mayor eficacia es importante para una separación eficaz, una mayor sensibilidad y/o identificación de componentes similares en una combinación de muestras compleja.

Los premios Nobel Martin y Synge, por analogía con la destilación, introdujeron el concepto de altura del plato [H, o H.E.T.P., altura equivalente a un plato teórico] como una medida de la eficacia cromatográfica y como un medio para comparar el rendimiento de la columna.† Presagiando la tecnología HPLC y UPLC, reconocieron que un lecho homogéneo de relleno con el tamaño de partícula más pequeño posible [que requiera una mayor presión] era clave para la máxima eficacia. La relación entre los parámetros de la columna y del sistema de cromatografía que afectan al ensanchamiento de bandas se describió más adelante en una ecuación de van Deemter.††

Los cromatógrafos a menudo se refieren a una cantidad que pueden calcular fácil y directamente a partir de las mediciones realizadas en un cromatograma, a saber, el número de platos [N], como eficacia. A continuación, se determina la altura del plato a partir de la relación entre la longitud del lecho de la columna y N [H = L/N; los métodos de cálculo de N a partir de un cromatograma se muestran en la figura U]. Es importante tener en cuenta que el cálculo de N o H utilizando estos métodos es correcto solo para condiciones isocráticas y no se puede utilizar para separaciones en gradiente.

†A.J.P. Martin y R.M. Synge, Biochem. J. 35: 1358–1368 [1941]
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg and A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci. 5: 271–289 [1956]

Eluato

La parte del eluyente que surge de la salida de la columna y contiene analitos en solución. En la HPLC analítica, el detector examina el eluato para determinar la concentración o masa de analitos que contiene. En la HPLC preparativa, el eluato se recoge continuamente en alícuotas a intervalos de tiempo o volumen uniformes, o de forma discontinua solo cuando un detector indica la presencia de un pico de interés. Estas fracciones se procesan posteriormente para obtener compuestos purificados.

Eluyente

La fase móvil [consultar Cromatografía de elución].

Serie eluotrópica

Una lista de eluyentes ordenados por la fuerza de elución con referencia a los analitos especificados en un sorbente estándar. Esta serie es útil cuando se desarrollan métodos de elución tanto isocráticos como en gradiente. Trappe acuñó este término después de mostrar que una secuencia de eluyentes de polaridad creciente podría separar las fracciones de lípidos en la alúmina.† Posteriormente, Snyder midió y tabuló los parámetros de fuerza de eluyentes para una gran lista de eluyentes en varios sorbentes de LC de fase normal.†† Neher creó un nomograma muy útil mediante el cual se podían elegir mezclas equi-eluotrópicas [fuerza de elución constante] de eluyentes en fase normal para optimizar la selectividad de las separaciones por TLC.†††

Una serie eluotrópica de fase normal típica comenzaría en el extremo débil con hidrocarburos alifáticos no polares, por ejemplo, pentano o hexano, y luego progresaría sucesivamente hasta benceno [un hidrocarburo aromático], diclorometano [un hidrocarburo clorado], éter dietílico, acetato de etilo [un éster], acetona [una cetona] y, por último, metanol [un alcohol] en el extremo fuerte [consultar la figura R-1].

†W. Trappe, Biochem. Z. 305: 150 [1940]
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker [1968], pp. 192–197
†††R. Neher in G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier [1964] pp. 75–86.

Eluir* [verbo]

Para cromatografiar mediante cromatografía de elución. El proceso de elución puede detenerse mientras todos los componentes de la muestra están todavía en el lecho cromatográfico [cromatografía en papel o en capa fina] o continuar hasta que los componentes hayan abandonado el lecho cromatográfico [cromatografía en columna].

Nota: Se prefiere el término eluir a desarrollar [un término utilizado en la cromatografía plana], para evitar confusión con la práctica del desarrollo de métodos, en el que un sistema de cromatografía [la combinación de fases móviles y estacionarias] se optimiza para una separación particular.

Cromatografía de elución*

Procedimiento de separación cromatográfica en el que la fase móvil pasa continuamente a través del lecho cromatográfico. En HPLC, una vez que la línea base del detector se ha estabilizado y el sistema de cromatografía ha alcanzado el equilibrio, se introduce un trozo de muestra finito en el flujo de fase móvil. La elución continúa hasta que todos los analitos de interés han pasado a través del detector.

Fuerza de elución

Una medida de la afinidad de un eluyente con respecto a la del analito por la fase estacionaria. Un eluyente débil no puede desplazar al analito, lo que hace que quede fuertemente retenido en la fase estacionaria. Un eluyente fuerte puede desplazar totalmente todas las moléculas de analito y transportarlas a través de la columna sin retenerlas. Para lograr un equilibrio adecuado entre una separación efectiva y un volumen de elución razonable, los eluyentes a menudo se mezclan para establecer una competencia adecuada entre las fases, optimizando así tanto la selectividad como el tiempo de separación para un conjunto determinado de analitos [consultar Selectividad].

El momento dipolar, la constante dieléctrica, el enlace de hidrógeno, el tamaño y la forma moleculares y la tensión superficial pueden indicar la fuerza de elución. La fuerza de elución también está determinada por el modo de separación. Se puede solicitar una serie eluotrópica de eluyentes aumentando la fuerza en una dirección en condiciones de adsorción o de fase normal; ese orden puede ser casi opuesto en condiciones de partición de fase reversa [consultar la figura R-1].

Detector de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia excitan una muestra con una longitud de onda de luz especificada. Esto hace que ciertos compuestos emitan fluorescencia y emitan luz a una longitud de onda más alta. Un sensor, configurado en una longitud de onda de emisión específica y enmascarado para no ser cegado por la fuente de excitación, solo capta la luz emitida. A menudo, los analitos que no presentan fluorescencia nativa pueden derivatizarse para aprovechar la alta sensibilidad y selectividad de esta forma de detección, p. ej., derivatización AccQ•Tag de aminoácidos.

Caudal*

El volumen de fase móvil que pasa a través de la columna en unidades de tiempo. En los sistemas HPLC, el controlador establece el caudal para el sistema de suministro de eluyente [bomba]. La exactitud del caudal se puede comprobar mediante la recogida programada y la medición del efluente en la salida de la columna. Debido a que la densidad de un eluyente varía con la temperatura, cualquier calibración o medición de caudal debe tener en cuenta esta variable. Las determinaciones más precisas se realizan, cuando es posible, en peso, no en volumen.

La uniformidad [precisión] y la reproducibilidad del caudal son importantes para muchas técnicas de LC, especialmente en separaciones en las que los tiempos de retención son fundamentales para la identificación del analito, o en la cromatografía por permeación de gel, en la que la calibración y la correlación de los tiempos de retención son fundamentales para realizar mediciones precisas de la distribución del peso molecular de los polímeros.

A menudo, las condiciones de separación se comparan mediante la velocidad lineal, no el caudal. La velocidad lineal se calcula dividiendo el caudal por el área de la sección transversal de la columna. Mientras que el caudal se expresa en volumen/tiempo [p. ej., mL/min], la velocidad lineal se mide en longitud/tiempo [p. ej., mm/s].

Cromatografía por permeación de gel*

Separación basada principalmente en los efectos de exclusión debidos a diferencias en el tamaño y/o la forma molecular. La cromatografía por permeación de gel y la cromatografía de filtración en gel describen el proceso cuando la fase estacionaria es un gel engrosado. Ambas son formas de cromatografía de exclusión por tamaño. Porath y Flodin describieron por primera vez la filtración en gel utilizando geles de dextrano y fases móviles acuosas para la separación de biomoléculas por exclusión de tamaño.† Moore aplicó principios similares a la separación de polímeros orgánicos por tamaño en solución utilizando fases móviles de eluyentes orgánicos en geles porosos de polímeros de divinilbenceno de poliestireno.††

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 [1959]
†† J.C. Moore, Patente de Estados Unidos 3.326.875 [presentada en enero de 1963; publicada en junio de 1967]

Gradiente

El cambio con el tiempo en las concentraciones relativas de dos [o más] componentes eluyentes miscibles que forman una fase móvil de fuerza de elución creciente. Un gradiente escalonado se utiliza normalmente en la extracción en fase sólida; en cada paso, la composición del eluyente cambia abruptamente de una fase móvil más débil a una fase móvil más fuerte. Incluso es posible, secando el lecho de sorbente de SPE entre pasos, cambiar de un eluyente a otro inmiscible.

Un gradiente continuo normalmente se genera mediante un sistema de mezcla de baja o alta presión [consultar las figuras J-2 y J-3] de acuerdo con una curva predeterminada [lineal o no lineal] que representa la concentración del eluyente B más fuerte en eluyente A inicial durante un periodo de tiempo fijo. Se puede programar una retención en una composición de eluyente isocrática fija en cualquier momento dentro de un gradiente continuo. Al final de una separación, el programa de gradiente también se puede configurar para volver a la composición de la fase móvil inicial para volver a equilibrar la columna en preparación para la inyección de la siguiente muestra. Los sistemas HPLC sofisticados pueden mezclar hasta cuatro o más eluyentes [o mezclas de eluyentes] en un gradiente continuo.

Inyector [Inyector automático, Sistema de gestión de muestras]

Mecanismo para introducir [inyectar] de forma exacta y precisa un volumen predeterminado y discreto de una solución de muestra en el flujo de fase móvil. El inyector puede ser un simple dispositivo manual o un inyector automático sofisticado que se puede programar para inyecciones sin supervisión de muchas muestras de una serie de viales o pocillos individuales en una secuencia predeterminada. La temperatura de los compartimentos de muestras de estos sistemas puede incluso controlarse para mantener la integridad de las muestras durante muchas horas de funcionamiento.

La mayoría de los inyectores modernos incorporan algún tipo de loop de muestras lleno de jeringas que se puede conectar o desconectar mediante una válvula multipuerto. Un sistema de inyección de volumen interno mínimo bien diseñado se sitúa lo más cerca posible de la entrada de la columna y minimiza la dispersión de la banda de muestra. Entre inyecciones de la muestra, también se pueden eliminar los residuos mediante la fase móvil o un eluyente de lavado, para evitar el arrastre [contaminación de la muestra actual por una anterior].

La mejor forma de preparar las muestras para la inyección es, si es posible, disolviéndolas en la fase móvil en la que se inyectarán; esto puede evitar problemas de separación y/o detección. Si se debe utilizar otro eluyente, es preferible que su fuerza de elución sea igual o menor que la de la fase móvil. A menudo es aconsejable mezclar un poco de una solución de muestra con la fase móvil fuera de línea para comprobar si hay precipitación o problemas de miscibilidad que puedan afectar a una correcta separación.

Sistema de introducción de muestra

El extremo del lecho de la columna donde entran el flujo de la fase móvil y la muestra. Un fritado poroso inerte retiene el material de relleno y protege la entrada del lecho sorbente de la contaminación por partículas. Las buenas prácticas de HPLC establecen que las muestras y las fases móviles deben estar libres de partículas; esto se vuelve imperativo para las columnas de partículas pequeñas cuyas entradas se obstruyen mucho más fácilmente. Si la entrada del lecho de la columna se obstruye y presenta una contrapresión más alta de lo normal, a veces, invertir la dirección del flujo mientras se dirige el efluente hacia el desecho puede desprenderse y eliminar los restos de muestra que se asientan sobre el fritado. Si los residuos han penetrado en el fritado y se han alojado en el extremo de entrada del lecho, lo más probable es que la columna haya llegado al final de su vida útil.

Cromatografía de intercambio iónico* [consultar la sección: Separaciones basadas en la carga].

Este modo de separación se basa principalmente en las diferencias en las afinidades de intercambio iónico de los componentes de la muestra. La separación de especies iónicas principalmente inorgánicas en agua o fases móviles acuosas tamponadas en columnas de intercambio iónico de partículas pequeñas, superficialmente porosas y de alta eficacia, seguida de detección conductimétrica o electroquímica, se denomina cromatografía iónica [IC].

Elución isocrática*

Un procedimiento en el que la composición de la fase móvil permanece constante durante el proceso de elución.

Cromatografía líquida* [LC]

Una técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido. La cromatografía de líquidos se puede realizar en columna o en un plano [cromatografía en papel o TLC]. La cromatografía líquida moderna que utiliza partículas más pequeñas y una mayor presión de entrada se denominó cromatografía líquida de alta resolución (o cromatografía líquida de alta presión [HPLC] en 1970). En 2004, la cromatografía líquida de ultra-alta resolución elevó drásticamente el rendimiento de la LC a un nuevo intervalo estable [consultar Tecnología UPLC].

Fase móvil* [ver Eluato, Eluyente]

Fluido que se filtra, en una dirección definida, a lo largo del lecho sorbente de la fase estacionaria. La fase móvil puede ser líquida [cromatografía líquida] o de gases [cromatografía de gases] o un fluido supercrítico [cromatografía de fluidos supercríticos]. En la cromatografía de gases, el gas portador de expresión se puede utilizar para la fase móvil. En la cromatografía de elución, la fase móvil también se puede denominar eluyente, mientras que la palabra eluato se define como la parte de la fase móvil que ha pasado a través del lecho sorbente y contiene los compuestos de interés en solución.

Cromatografía de fase normal*

Procedimiento de elución en el que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil. Este término se utiliza en cromatografía líquida para enfatizar el contraste con la cromatografía de fase reversa.

Pico * [ver Número de platos]

Parte de un cromatograma diferencial que registra la respuesta del detector mientras se eluye un solo componente de la columna. Si la separación es incompleta, dos o más componentes pueden eluirse como un pico no resuelto. Los picos eluidos en condiciones óptimas a partir de una columna eficiente y bien rellenada, que funciona en un sistema que minimiza el ensanchamiento de bandas, se aproximan a la forma de una distribución gaussiana. La cuantificación se suele realizar midiendo el área del pico [delimitada por la línea base y la curva del pico]. Con menos frecuencia, la altura del pico [la distancia medida desde el máximo del pico hasta la línea base] se puede utilizar para la cuantificación. Este procedimiento requiere que tanto la anchura como la forma del pico permanezcan constantes.

Número de platos* [N, consultar Eficacia]

Un número indicativo del rendimiento de la columna [eficacia o potencia de separación mecánica, también llamado recuento de platos teóricos o número de platos teóricos]. Relaciona la magnitud de la retención de un pico con su anchura [varianza o ensanchamiento de banda]. Para hacer un recuento de platos, se supone que un pico puede representarse mediante una distribución gaussiana [una curva de campana estadística]. En los puntos de inflexión [60,7 % de la altura del pico], la anchura de una curva gaussiana es el doble de la desviación estándar [σ] respecto a su media [situada en el máximo del pico]. Como se muestra en la figura U, la anchura del pico de una curva gaussiana medida en otras fracciones de la altura del pico se puede expresar en múltiplos de σ definidos con precisión. La retención del pico [volumen de retención, V_R o tiempo de retención, t_R] y la anchura del pico deben expresarse en las mismas unidades, ya que N es un número adimensional. Hay que tener en cuenta que el método de 5 sigma para calcular N es una medida más estricta de la homogeneidad y el rendimiento de la columna, ya que se ve más afectado por la asimetría de los picos. Las estaciones de datos informáticas pueden delimitar automáticamente cada pico resuelto y calcular su número de platos correspondiente.

Cromatografía preparativa

El proceso de utilizar cromatografía líquida para aislar un compuesto en una cantidad y con un nivel de pureza suficientes para experimentos o usos posteriores. Para procesos de purificación farmacéuticos o biotecnológicos, se pueden utilizar columnas de varios pies de diámetro para varios kilogramos de material. Para aislar solo unos pocos microgramos de un producto natural valioso, es suficiente una columna de HPLC analítica. Ambos son métodos cromatográficos preparativos, que solo difieren en la escala [consultar la sección sobre escala de HPLC y la tabla A].

Resolución* [Rs, consultar Selectividad]

La separación de dos picos, expresada como la diferencia entre sus respectivos tiempos de retención, dividida por la anchura media de pico en la línea base. R_s = 1,25 indica que dos picos de igual anchura están separados en la línea base. Cuando R_s = 0,6, la única indicación visual de la presencia de dos picos en un cromatograma es una pequeña muesca cerca del máximo del pico. Las columnas de mayor eficacia producen picos más estrechos y mejoran la resolución para separaciones difíciles; sin embargo, la resolución aumenta solo en la raíz cuadrada de N. El método más eficaz para aumentar la resolución es aumentar la selectividad modificando la combinación de fase móvil/estacionaria utilizada para la separación cromatográfica [consultar la sección sobre Potencia de separación química].

Factor de retención* [k]

Una medida del tiempo que el componente de la muestra permanece en la fase estacionaria en relación con el tiempo que permanece en la fase móvil; expresa cuánto tiempo más retarda la fase estacionaria un componente de la muestra de lo que tardaría en viajar a través de la columna con la velocidad de la fase móvil. Matemáticamente, es la relación entre el tiempo de retención [volumen] ajustado y el tiempo de espera [volumen]: k = t_R'/t_M [consultar Tiempo de retención y selectividad].

Nota: Anteriormente, este término también se expresaba como ratio de partición, ratio de capacidad, factor de capacidad o ratio de distribución de masa, y se simbolizaba con k'.

Tiempo de retención* [tR]

El tiempo entre el inicio de la elución [normalmente, en HPLC, el momento de la inyección o la introducción de la muestra] y la aparición del máximo del pico. El tiempo de retención ajustado, t_R', se calcula restando de t_R el tiempo de espera [t_M, el tiempo desde la inyección hasta la elución del pico máximo de un analito totalmente no retenido].

Cromatografía de fase reversa*

Un procedimiento de elución utilizado en cromatografía líquida en el que la fase móvil es significativamente más polar que la fase estacionaria, p. ej., un material microporoso a base de sílice con cadenas alquílicas unidas químicamente a su superficie accesible. Nota: Evitar el término incorrecto fase reversa. [Consultar la referencia 4 para obtener algunas nuevas ideas sobre el mecanismo de las separaciones de fase reversa.]

Selectividad [Factor de separación, σ]

Término utilizado para describir la magnitud de la diferencia entre las afinidades termodinámicas relativas de un par de analitos por las fases móvil y estacionaria especificadas que componen el sistema de cromatografía. El término adecuado es factor de separación [σ]. Es igual a la relación de los factores de retención, k2/k1 [consultar Factor de retención]; por definición, σ es siempre ≥ 1. Si σ = 1, ambos picos se coeluyen y no se obtiene separación. En la cromatografía preparativa es importante maximizar el valor α para lograr la máxima capacidad de carga y rendimiento de la muestra. [consultar la sección sobre Potencia de separación química].

Sensibilidad* [S]

La señal de salida por unidad de concentración o unidad de masa de una sustancia en la fase móvil que entra en el detector; p.ej., la pendiente de una curva de calibración lineal [consultar Detector]. Para los detectores sensibles a la concentración [p. ej., absorbancia UV/VIS], la sensibilidad es la relación entre la altura del pico y la concentración del analito en el pico. Para los detectores sensibles al flujo másico, es la relación entre la altura del pico y la masa unitaria. Para que la sensibilidad sea una característica de rendimiento única, debe depender únicamente del proceso de medición química, no de los factores de escala.

La capacidad de detectar [calificar] o medir [cuantificar] un analito depende de muchos factores instrumentales y químicos. Son ideales los picos bien resueltos [máxima selectividad] que eluyen de las columnas de alta eficacia [anchura de pico estrecha con buena simetría para la altura máxima del pico], así como una buena sensibilidad y especificidad del detector. Tanto la interferencia del sistema de cromatografía como el ruido de los componentes electrónicos también deben minimizarse para lograr la máxima sensibilidad.

Extracción en fase sólida [SPE]

Una técnica de preparación de muestras que utiliza los principios de LC para aislar, enriquecer y/o purificar analitos de una matriz compleja aplicada a un lecho cromatográfico en miniatura. La SPE fuera de línea se realiza [manualmente o mediante automatización] con partículas más grandes en cartuchos de plástico individuales o en pocillos de placas de microelución, utilizando presión positiva baja o vacío para ayudar al flujo. La SPE en línea se realiza con partículas más pequeñas en columnas de HPLC en miniatura, utilizando presiones más altas y una válvula para cambiar la columna de SPE en línea con la columna de HPLC primaria, o fuera de línea para desechar, según corresponda.

Los métodos de SPE utilizan gradientes escalonados [consultar Gradiente] para realizar los pasos de acondicionamiento del lecho, carga de muestras, lavado y elución. Las muestras se cargan normalmente en condiciones en las que el valor k de los analitos importantes es lo más alto posible, de modo que se retienen por completo durante las etapas de carga y lavado. A continuación, se realiza la elución cambiando a una mezcla de eluyentes mucho más fuerte [consultar Fuerza de elución]. El objetivo es eliminar las interferencias de la matriz y aislar el analito en una solución y en una concentración adecuada para el análisis posterior.

Velocidad [consultar Eficacia, Caudal, Resolución]

Una ventaja de trabajar con separaciones de LC a velocidades lineales más altas utilizando columnas analíticas de menor volumen y partículas más pequeñas, o columnas preparativas de mayor volumen y partículas más grandes. Los avances de un orden de magnitud en la velocidad de LC se produjeron en 1972 [con el uso de partículas de 10 μm y bombas capaces de proporcionar un flujo de fase móvil preciso a 6000 psi], en 1976 [con columnas preparativas de 75 μm operadas a un caudal de 500 mL/min] y en 2004 [con la introducción de la tecnología UPLC: columnas de partículas de 1,7 µm que funcionaron a 15 000 psi].†

Los sistemas analíticos de cromatografía líquida de alta velocidad no solo deben admitir presiones más altas en todo el sistema de fluidos; el tiempo del ciclo del inyector debe ser corto; los mezcladores en gradiente deben ser capaces de realizar cambios rápidos entre muestras; los sensores del detector deben responder rápidamente a pequeños cambios en la composición del eluato; y los sistemas de datos deben recopilar las docenas de puntos necesarios por segundo para representar gráficamente y cuantificar picos estrechos con precisión.

Juntos, una mayor resolución, una mayor velocidad y una mayor eficacia suelen proporcionar un mayor rendimiento. Se pueden analizar más muestras en una jornada laboral. Se pueden purificar cantidades más grandes de compuesto por análisis o período de proceso.

Fase estacionaria*

Una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel o un líquido. Si es líquido, se puede distribuir sobre un sólido. Este sólido puede contribuir o no al proceso de separación. El líquido también se puede unir químicamente al sólido [fase de unión] o inmovilizarse sobre él [fase inmovilizada].

La expresión lecho cromatográfico o sorbente se puede utilizar como término general para designar cualquiera de las diferentes formas en las que se utiliza la fase estacionaria.

Se desaconseja el uso del término fase líquida para designar la fase móvil en LC. Esto evita la confusión con la cromatografía de gases, en la que la fase estacionaria se denomina fase líquida [la mayoría de las veces un líquido recubierto de un soporte sólido].

La cromatografía de partición líquido-líquido en columna abierta [LLC] no se traducía bien en HPLC. Fue reemplazada por el uso de rellenos de fase de unión. La LLC demostró ser incompatible con los detectores modernos debido a problemas con el sangrado del recubrimiento líquido de la fase estacionaria de su soporte sólido, contaminando así la fase móvil líquida inmiscible.

Tecnología UPLC

El uso de un sistema de LC de alta eficacia diseñado de forma holística para admitir partículas de menos de 2 µm y una presión de funcionamiento muy alta se denomina cromatografía líquida de ultra-alta resolución [tecnología UPLC].† Los principales beneficios de esta tecnología son mejoras significativas en la resolución con respecto a la HPLC y/o tiempos de análisis más rápidos, al tiempo que se mantiene la resolución observada en una separación HPLC existente.

†Para obtener más información, visitar: https://www.waters.com/uplc.