Guía de iniciación a la cromatografía líquida

Los componentes de un sistema básico de cromatografía líquida de alta resolución [HPLC] se muestran en el diagrama simple de la figura E.

Un recipiente contiene el eluyente [llamado fase móvil, porque se mueve]. Se utiliza una bomba de alta presión [sistema de suministro de eluyentes o sistema de gestión de eluyentes] para generar y medir un caudal específico de fase móvil, normalmente mililitros por minuto. Un inyector [sistema de gestión de muestras o inyector automático] puede introducir [inyectar] la muestra en la corriente de fase móvil que fluye continuamente y que lleva la muestra a la columna de HPLC. La columna contiene el material de relleno cromatográfico necesario para realizar la separación. Este material de relleno se denomina fase estacionaria porque se mantiene en su lugar mediante el hardware de la columna. Se necesita un detector para ver las bandas de compuestos separadas a medida que se eluyen de la columna de HPLC [la mayoría de los compuestos no tienen color, por lo que no podemos verlos con los ojos]. La fase móvil sale del detector y se puede desechar o recoger, según se desee. Cuando la fase móvil contiene una banda de compuesto separada, la HPLC proporciona la capacidad de recoger esta fracción del eluato que contiene ese compuesto purificado para su posterior estudio. Esto se denomina cromatografía preparativa [que se analiza en la sección sobre la escala de HPLC].

Hay que tener en cuenta que se utilizan tubos y conectores de alta presión para interconectar los componentes de la bomba, el inyector, la columna y el detector para formar el conducto para la fase móvil, la muestra y las bandas compuestas separadas.

El detector está conectado a la estación de datos del equipo, el componente del sistema HPLC que registra la señal eléctrica necesaria para generar el cromatograma en su pantalla y para identificar y cuantificar la concentración de los componentes de la muestra (consultar la figura F). Debido a que las características de los compuestos de la muestra pueden ser muy diferentes, se han desarrollado varios tipos de detectores. Por ejemplo, si un compuesto puede absorber luz ultravioleta, se utiliza un detector de absorbancia UV. Si el compuesto emite fluorescencia, se utiliza un detector de fluorescencia. Si el compuesto no tiene ninguna de estas características, se utiliza un tipo de detector más universal, como un detector de dispersión de la luz por evaporación [ELSD]. El enfoque más eficaz es el uso de varios detectores en serie. Por ejemplo, se puede utilizar un detector UV y/o ELSD en combinación con un espectrómetro de masas [MS] para analizar los resultados de la separación cromatográfica. Esto proporciona, a partir de una sola inyección, información más completa sobre un analito. La práctica de acoplar un espectrómetro de masas a un sistema HPLC se denomina LC-MS.

Funcionamiento de HPLC

Una forma sencilla de comprender cómo se logra la separación de los compuestos contenidos en una muestra es ver el diagrama de la figura G.

La fase móvil entra en la columna por la izquierda, atraviesa el lecho de partículas y sale por la derecha. La dirección del flujo está representada por flechas verdes. Primero, hay que tener en cuenta la imagen superior; representa la columna en el momento cero [el momento de la inyección], cuando la muestra entra en la columna y comienza a formar una banda. La muestra que aparece aquí, una mezcla de colorantes amarillo, rojo y azul, aparece en la entrada de la columna como una sola banda negra. [En realidad, esta muestra podría ser cualquier cosa que se pueda disolver en un eluyente; normalmente, los compuestos serían incoloros y la pared de la columna, opaca, por lo que se necesitaría un detector para ver los compuestos separados a medida que se eluyen.]

Después de unos minutos [imagen inferior], durante los cuales la fase móvil fluye de manera continua y constante a través de las partículas del material de relleno, se puede ver que los colorantes individuales se han movido en bandas separadas a diferentes velocidades. Esto se debe a que existe una competencia entre la fase móvil y la fase estacionaria para atraer cada uno de los colorantes o analitos. Obsérvese que la banda de colorante amarilla se mueve más rápido y está a punto de salir de la columna. Al colorante amarillo le gusta [se siente atraído por] la fase móvil más que a los otros colorantes. Por lo tanto, se mueve a una velocidad más rápida, más cercana a la de la fase móvil. A la banda de colorante azul le gusta más el material de relleno que la fase móvil. Su mayor atracción por las partículas hace que se mueva significativamente más lenta. En otras palabras, es el compuesto más retenido en esta combinación de muestras. La banda de colorante rojo tiene una atracción intermedia para la fase móvil y, por lo tanto, se mueve a una velocidad intermedia a través de la columna. Debido a que cada banda de colorante se mueve a una velocidad diferente, podemos separarla cromatográficamente.

¿Qué es un Detector?

A medida que las bandas de colorante separadas salen de la columna, pasan inmediatamente al detector. El detector contiene una celda de flujo que ve [detecta] cada banda compuesta separada sobre un fondo de fase móvil [consultar la figura H]. [En realidad, las soluciones de muchos compuestos a las concentraciones analíticas típicas de HPLC son incoloras.] Un detector adecuado tiene la capacidad de detectar la presencia de un compuesto y enviar la señal eléctrica correspondiente a una estación de datos informática. Se puede elegir entre muchos tipos diferentes de detectores, en función de las características y concentraciones de los compuestos que deben separarse y analizarse, como se ha indicado anteriormente.

¿Qué es un Cromatograma?

Un cromatograma es una representación de la separación que se ha producido químicamente [cromatográficamente] en el sistema HPLC. Se dibuja una serie de picos que se elevan desde una línea base en un eje de tiempo. Cada pico representa la respuesta del detector para un compuesto diferente. La estación de datos del ordenador traza el cromatograma [consultar la figura H].

En la figura H, la banda amarilla ha pasado por completo a través de la celda de flujo del detector; la señal eléctrica generada se ha enviado a la estación de datos del ordenador. El cromatograma resultante ha comenzado a aparecer en la pantalla. Hay que tener en cuenta que el cromatograma comienza cuando se inyecta la muestra por primera vez y comienza como una línea recta cerca de la parte inferior de la pantalla. Esto se denomina línea base; representa la fase móvil pura que atraviesa la celda de flujo a medida que transcurre el tiempo. A medida que la banda de analito amarilla pasa a través de la celda de flujo, se envía una señal más fuerte al equipo informático. La línea se curva, primero hacia arriba y después hacia abajo, en proporción a la concentración del colorante amarillo en la banda de la muestra. Esto crea un pico en el cromatograma. Una vez que la banda amarilla sale por completo de la celda del detector, el nivel de la señal vuelve a la línea base; la celda de flujo ahora tiene, una vez más, solo una fase móvil pura. Debido a que la banda amarilla se mueve más rápido, eluyendo primero de la columna, es el primer pico que se extrae.

Poco después, la banda roja llega a la celda de flujo. La señal aumenta desde la línea base cuando la banda roja entra por primera vez en la celda y comienza a dibujarse el pico que representa la banda roja. En este diagrama, la banda roja no ha pasado por completo a través de la celda de flujo. El diagrama muestra cómo se verían la banda roja y el pico rojo si se detuviera el proceso en este momento. Dado que la mayor parte de la banda roja ha pasado a través de la celda, se ha trazado la mayor parte del pico, como lo muestra la línea continua. Si se pudiera reiniciar, la banda roja pasaría por completo a través de la celda de flujo y se completaría el pico rojo [línea de puntos]. La banda azul, la más retenida, viaja a la velocidad más lenta y eluye después de la banda roja. La línea de puntos muestra cómo se vería el cromatograma completo si se hubiera dejado que el análisis continuara hasta su finalización. Es interesante observar que la anchura del pico azul será la más amplia porque la anchura de la banda del analito azul, aunque es más estrecha en la columna, se vuelve más ancha a medida que eluye de la columna. Esto se debe a que se mueve más lentamente a través del lecho de material de relleno cromatográfico y requiere más tiempo [y volumen de fase móvil] para eluir por completo. Dado que la fase móvil fluye continuamente a una velocidad fija, esto significa que la banda azul se ensancha y está más diluida. Debido a que el detector responde en proporción a la concentración de la banda, el pico azul tiene una altura más baja, pero una anchura mayor.