HPLC峰型問題疑難排解

峰型變化是HPLC分析的常見問題之一。理想的層析峰應對稱並呈高斯形狀[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353-362]。計算USP拖尾因子(T)可以將峰型對稱性量化，如圖1所示。拖尾因子的值等於1表示完全對稱，小於1稱為前傾峰，大於1則稱為拖尾峰。許多方法特別要求所有層析峰的拖尾因子不得高於指定限制。拖尾因子較高可能會降低相鄰沖堤峰的解析度，增加積分難度[D. R. Stoll，LC-GC，N. Am.39 (2021), pp.353-362]。

使用既定方法分析一批樣品時，在連續進樣的情況下，峰型有時候可能會出現變化。這種情況可能會導致拖尾因子不符合要求。有幾個原因可能會導致這個問題，包括HPLC系統、移動相、樣品以及管柱發生問題[J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385-420]。要進行疑難排解，建議先仔細分析層析圖，從中觀察峰型變化出現是在所有峰抑或部分峰。若是後者，請觀察層析峰發生變化之分析物的屬性，確認這些分析物與層析峰未發生變化的分析物有何不同。有問題的分析物是鹼性/酸性物質，而其他分析物不是？若是如此，原因可能在於固定相表面電荷變化或移動相pH值變化。如果在逆相方法中，鹼性分析物出現峰型變化，而其他分析物沒有，原因之一可能在於固定相少了封端基，導致矽醇基濃度增加。鹼性顆粒上的離子化矽醇基是鹼性分析物峰出現拖尾現象的常見原因之一[D. V. McCalley, Chem.Comm.59 (2023), pp.7887-7899]。

如果層析圖中的層析峰全數顯示出相似的峰型變化，可能原因之一是連接管柱和HPLC系統的管路滑動鬆脫。使用PEEK手擰式接頭有可能會發生這種情況。另一個可能的原因是管柱中有空隙，當管柱接觸到壓力快速變化的環境，或者在導致固定相載體顆粒水解的pH值和/或溫度條件下使用時，都有可能發生這種情況。這種情況在矽膠管柱搭配鹼性(pH>7)移動相使用時很常見，尤其在高溫(>30 °C)下[J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr.A 691 (1995), pp.3–19., H. A. Claessens, M. A. van Straten, J. J. Kirkland, J. Chromatogr.A 728 (1996), pp.259-270]。第三種可能的原因是樣品基質成分堆積在HPLC系統和/或管柱內。許多樣品含蛋白質、脂質、多醣和界面活性劑等成分，這類成分會沉澱或牢牢吸附於系統和管柱表面。這類成分堆積在系統和/或管柱表面之後，可能會破壞流量分佈，導致所有層析峰的峰型出現變化。

請參考圖2所示的層析圖。初始層析圖顯示，五個層析峰的拖尾因子良好，範圍介於1.01~1.09。進樣200次後的層析圖顯示，五個層析峰的拖尾因子全數增加，範圍介於1.61~1.97。經過200次進樣，柱壓只有略增(3.5%)。

這些分析物在分離處理條件下都是中性的，因此，固定相表面矽醇基濃度變化不會是導致層析峰拖尾的原因。移動相只含水和乙腈，管柱溫度是40°C，因此，管柱出現空隙的可能性不高。樣品基質成分在管柱中堆積的情況呢？樣品含有蛋白質、脂肪和糖。本範例使用的管柱有個可拆卸的一體成形保護管柱。換成新的保護管柱後，五種成分的拖尾因子都恢復到接近1的值，如下方層析圖所示。由此可知，層析峰拖尾的原因是樣品基質成分在保護管柱中堆積所致。處理的樣品若含可能會沉澱或牢牢吸附於管柱上的基質成分，利用保護管柱盡可能延長管柱使用壽命，可能會是一種相對省錢的方法。如本範例所示，這也是能用於找出峰型問題根本原因的工具，相當實用。