進樣量增加帶來的峰型變化

如本系列文章所探討，峰型變化是HPLC分析常見的問題。理想的層析峰應對稱並呈高斯形狀[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353-362]。計算USP拖尾因子(T)可以將峰型對稱性量化，如圖1所示。拖尾因子的值等於1表示完全對稱，小於1稱為前傾峰，大於1則稱為拖尾峰。許多方法要求所有層析峰的拖尾因子皆須保持在指定範圍內。拖尾因子若明顯偏離1，可能會降低相鄰沖堤峰的解析度，增加積分難度[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353-362]。此外，層析峰對稱性若較差，峰寬通常會大於預期，導致峰高降低。在牽涉到低濃度分析物偵測與定量的應用中，這種情況可能會降低結果精密度，以及定量極限與偵測極限。

開發低濃度分析物定量方法時，優化進樣量是相當重要的步驟。理想情況下，固定樣品成分的峰高和峰面積會隨進樣量線性增加，直到發生質量、體積或偵測器過載現象[U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997, pp.355-356]。圖2A所示範例使用5–95%乙腈梯度分離六種分析物的混合物，每種分析物的濃度各為0.2 µg/mL。進樣量是2 µL，使用2.1 x 50 mm管柱，因此，進樣量是管柱體積的1.1%。由於一般指導原則是進樣量應為管柱體積的1–10% [Waters知識庫48961]，因此似乎仍有空間以增加進樣量的方式提高訊噪比。進樣量增加到4 µL時得到的層析圖如圖2B所示。六個層析峰的峰面積如預期全數增加至兩倍，但前兩個層析峰的峰高並沒有增加，而是變寬，並且出現明顯的前傾峰。

如前兩部分所述，有幾個原因會導致層析峰對稱性出現變化，包括HPLC系統、移動相、樣品以及管柱發生問題[J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385-420]。如前所述，要進行疑難排解，建議先仔細分析層析圖，從中觀察峰型變化出現是在所有峰抑或部分峰。如果層析圖中只有部分層析峰出現前傾峰，如圖2B所示，可能原因包括干擾化合物共析、質量過載，以及使用的樣品溶劑強度太高。由於是在增加進樣量之後觀察到這個問題，且分析物濃度較低，因此後者的可能性較高。圖2A和2B所示層析圖使用的樣品溶劑是50/50 v/v乙腈/水，選擇這個溶劑的原因是某些分析物在水中的溶解度有限。由於梯度開始的乙腈濃度只有5%，因此，樣品溶劑的強度遠高於初始移動相。最先沖堤的分析物疏水性最弱，受強樣品溶劑的影響自然最大。為驗證這項假設，我們以相同的分析物濃度，但乙腈/水的比例不同，製備了一系列樣品。前兩個層析峰的拖尾因子結果如圖3所示。兩種分析物的拖尾因子都隨著乙腈濃度增加而減小，證明使用強樣品溶劑正是造成圖2B所示前傾峰的原因。為避免這個問題，我們在確定疏水性最強的分析物能夠確實溶解的前提下，選擇了10%的乙腈濃度。進樣4 µL溶於10/90 v/v乙腈/水的樣品後得到的層析圖如圖2C所示。現在，相較於2 µL進樣量，所有層析峰的峰高均如預期增加至兩倍，層析峰對稱性良好。優化進樣量時，一定要考慮樣品溶劑相對於初始移動相成分的強度。