UPLC初學者指南

在上一節中，管柱顆粒越小，系統譜帶擴散[儀器和管柱兩者]徹底減少的好處已經確定無誤。UPLC技術可以徹底減少系統譜帶擴散，促進層析效能提高，在更短的時間內實現更有效的分離，達到更好的數據品質。可是譜帶擴散並不是使用小顆粒就能解決而達到效能的唯一因素。儀器存在的壓力也有很大的影響。

當移動相通過幫浦到進樣器、進樣器到管柱的連接管，流進管柱、柱後管路以及偵測器流體槽時，本來就會產生壓力。系統壓力的計算是以上所有元件[儀器和管柱]的累積效應。隨著流速增加，移動相流經連接管本身產生的壓力也會增加。此外，管路內徑及其長度也會影響在所採用的流速下產生的壓力。如果從系統總壓力[儀器 + 管柱]中減去儀器本身產生的壓力，就可以將兩支管柱之間的壓力差對照理論預測值。

當粒徑減小時，背壓會以與粒徑平方成反比的速率增加。同時，最佳移動相速度[線性速度]會隨著粒徑變小而增快。因此，指定粒徑大小在最佳線性速度下的壓力，會以與粒徑立方成反比的速率增加[圖44]。

如果試圖在傳統HPLC儀器上使用較小顆粒的管柱來提高層析分離解析度[保持柱長不變，同時減小粒徑]，或提高分析速度同時保持解析度[保持L/d_p比率不變]，這將是一大限制。鑒於傳統HPLC儀器的壓力限制 [350–400 bar；5000–6000 psi]，使用更小的顆粒通常會使得柱長受限，或只能在欠佳的線性速度[流速]下運作。

在柱長不變的情況下，理論上，若粒徑從5.0 µm減小到1.7 µm[粒徑減小3倍]，背壓預計會增加27倍。當從5.0 µm管柱移至相同長度的1.7 µm管柱時，系統壓力與理論預測值相近，增加22倍。正如觀測結果所見，1.7 µm管柱的運作壓力遠高於傳統HPLC儀器的壓力上限[圖45]。

在ACQUITY UPLC系統問世之前，sub-2 µm顆粒管柱[和對應的LC儀器]從未大受歡迎的一大原因是，粒徑減小會有背壓大幅提高的後果。

如果分離目標是縮短分析時間，同時保持解析度[保持L/d_p比率不變]，則增加的壓力遠小於粒徑減小時保持柱長不變的情況。壓力變化會因為柱長按比例減短而與粒徑平方[非粒徑立方]成反比。

在本例中，柱長和粒徑都減小3倍[圖47]。這代表背壓預計將增加9倍。觀測值與理論預測值相當吻合。在L/d_p保持不變的情況下，從5.0 µm、150 mm長的管柱移至1.7 µm、50 mm長的管柱時，可觀測到背壓增加了11倍。

以最佳流速運作時，較小顆粒產生的壓力會超過傳統HPLC系統的壓力限制。ACQUITY UPLC系統[壓力上限為1030 bar，15,000 psi]可以適應這些壓力，讓sub-2 µm顆粒能夠以最佳流速成功運作。

升高溫度

若要補償由小顆粒產生的較高壓力，有個方法是提高管柱溫度。隨著管柱溫度升高，移動相黏度會變低，進而讓背壓降低[如果流速保持不變]。可是，分析物分子進出固定相孔隙[擴散]的速度也會增加，導致需要提高流速才能保持效能。

將管柱溫度從30 °C提高到90 °C時，必須提高流速才能保持效率[圖48]。在比較任一溫度下與層析分離理論一致的最高平板計數時，並未觀測到效率提高的結果。

如果按照系統壓力繪製出平板計數的比較圖，就可以看到更意思的比較[圖49]。以這種方式繪製數據，可以清楚地看到在大致相同的系統壓力下達到最大效率，而且不受分離溫度影響。也就是說，不能使用升高溫度的辦法來規避使用小顆粒管柱造成的壓力。換句話說，傳統HPLC儀器不適合讓非常小的顆粒達到有效使用的效果。