UPLC初學者指南

運用UPLC技術提高效率

整體系統設計

瞭解本入門讀本中概述的層析分離原理及其應用方式，就能明顯知道要達到最大的分離效能，僅考慮小顆粒和更高壓力尚且不足。為了獲得sub-2 µm顆粒管柱的層析分離優勢，必須在專門設計的儀器上運作這些管柱，才能適應較小顆粒產生的壓力，盡可能減少譜帶擴散。這是傳統HPLC系統無法實現的。

ACQUITY極致效能液相層析系統是一個經過整體設計的解決方案，將儀器和管柱設計各個方面都設想周到，因此能提高層析分離效能和分析數據的品質。

圖50：整體設計的UPLC技術。

目前可以明確的是，UPLC分離的關鍵就是結合儀器和管柱效能，讓層析分離人員能夠充分體認並善用sub-2 µm顆粒管柱的強大特性。為此，要徹底減少柱內[管柱內]和柱外[管柱外]的譜帶擴散，並讓這些小顆粒管柱能在最佳線性速度[和壓力]下運作[圖51]。

圖51：在快速、低譜帶擴散的LC儀器中，以最佳線性速度運作的能力，是讓sub-2 µm顆粒管柱效能提升的關鍵。在此例中，我們於完全最佳化的微孔隙HPLC儀器與標準ACQUITY UPLC儀器上，使用相同的層析分離條件[除了指出的流速外]分析了四種咖啡因代謝物。效率、解析度、峰型和峰高均有所提升，說明UPLC技術及其整體系統設計的優勢。

充分發揮分離能力

為了充分發揮分離能力，可以結合使用小顆粒與升高溫度和提高壓力的做法，憑藉UPLC技術來開發超高效率的分離方法。

圖52A顯示，一支長150 mm的1.7 µm UPLC管柱在90°C下可產生近40,000個平板計數。串聯加入第二支管柱可使柱長達到300 mm，進而產生83,000個平板計數[圖52B]。串聯加入第三支管柱，獲得一支長450 mm並填充1.7 µm顆粒的UPLC管柱，發揮ACQUITY UPLC系統的完整壓力範圍。如圖52C所示，短短8分鐘即可達到121,000個平板計數的效率。

圖52：將提升溫度的做法與UPLC技術相結合，盡可能增加平板計數。

使用同樣的邏輯也可以提高梯度分離能力。在本例中，兩支150 mm長的1.7 µm UPLC管柱[總長300 mm]串聯使用，顯著增加了代謝物鑑定獲得的資訊量[圖53]。一小時的運作時間內達到1,000以上的峰容量。這種尿液樣本的完全表徵分析能力，可以鑑定出候選藥物的代謝物、偵測並鑑定出毒性標誌物，以及偵測治療藥物監測中的毒素。從此例中可觀察到，解析能力和質譜品質大大提高，進而簡化了數據分析、改善偵測極限並提高實驗可信度。

圖53：將提升溫度的做法與UPLC技術相結合，盡可能提高糖尿病尿液樣本的峰容量。

一台系統即可解決HPLC和UPLC分離任務

ACQUITY UPLC系統的用途是，因應日益嚴峻的組織挑戰，讓產品更快上市，同時堅持或提高資訊品質。自2004年以來，已有無數家組織採用UPLC技術作為例行分析平台，取代了傳統的HPLC。

採用新技術時，一定要考慮到能滿足現有和未來需求的能力。有了UPLC技術，就等於擁有一台兩全其美的系統，不僅能以最佳方式運作sub-2 µm管柱，還兼具運作傳統HPLC方法的穩定性與耐用性，絕對是未來划算的一筆投資。也就是說，不管分離需求為何，一個技術平台就足以使用，簡化方法轉移的步驟，進而提高效率。

圖54顯示了ACQUITY UPLC系統作為標準HPLC運作的範例。這是Excedrin[非處方止痛藥]在傳統HPLC系統[圖54A]和ACQUITY UPLC系統[圖54B]上運作的USP方法。層析分離方法、移動相、樣品和管柱只需從一台儀器轉移到另一台儀器即可。由於採用了最佳系統設計，在ACQUITY UPLC系統上進行同樣的實驗時，可以觀測到效率和靈敏度雙雙提高，而選擇性或相對滯留性則保持不變。

圖54：ACQUITY UPLC儀器作為標準HPLC的效能。XBridge C18 4.6 x 100 mm, 5 µm管柱，在45 °C下以2.0 mL/min的速度運作，移動相為73:23:3水:甲醇:乙酸。偵測條件為275 nm、5 Hz，數位濾波器 = 0.1。

總結

這本技術入門讀本主要是讓讀者對依據UPLC技術的層析分離原理有一個基本的認識。盼讀者目前能瞭解，徹底減少儀器和管柱兩者的譜帶擴散，可以大大提高層析分離的解析度、靈敏度和速度。這樣的系統除了讓譜帶擴散徹底減少之外，還要讓小[sub-2 µm]顆粒管柱能在最佳線性速度[和壓力]下運作。ACQUITY UPLC系統可以一次滿足分離處理科學家目前和未來的需求。

本入門讀本提及的理論效率和解析度增益為幾十年前預測的數據。2004年ACQUITY UPLC系統問世，這項理論才首次於市面上付諸實踐。自此以後，世界各地成千上萬的分離處理科學家紛紛改用UPLC技術，善用其為組織帶來的實際優勢。ACQUITY UPLC系統可以提高層析分離資訊的品質，縮短得出資訊所需的時間，讓組織能更有效地管理公司資產。這套系統克服了分析分離實驗室中存在的許多挑戰和瓶頸，因此提高組織效率。除了大大節省顯而易見的消耗品成本外，分離處理時間更短、更可靠，能大幅降低有機溶劑的用量，對環境也更加友善。

當初大多數領先的儀器製造商都低估了層析分離系統能適應更高壓力的重要性[以安全性、穩定性、樣品相容性等考量為證]，但在開發自家各種耐高壓系統時，現在也都證實了他們對這種LC平台有所需求。雖然這套系統確實也有不少地方需要折衷[例如，壓力限制變低、譜帶擴散更大、偵測選擇有限等]，不過層析效能變高是勢在必行的趨勢，代表分離處理科學仍持續進步當中。

可供進一步學習的參考資料：

U.D. Neue, “HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice,” Wiley-VCH [1997]
J.C. Aresenault and P.D. McDonald, “Beginners Guide to Liquid Chromatography,” Waters [2009]
P.D. McDonald, “The Quest for Ultra Performance in Liquid Chromatography: Origins of UPLC Technology,” Waters [2009]
M.P. Balogh, “The Mass Spectrometry Primer,” Waters [2009]