UPLC初學者指南

樣品混合物從樣品瓶轉移到正在流動的液體流[移動相]中，然後在高壓幫浦的作用下由移動相帶往管柱頭。移動相和進樣的樣品混合物進入管柱，經過顆粒層床後離開，將分離的混合物轉移到偵測器[圖3]。

首先，讓我們設想一下，樣品譜帶如何分離成單獨的分析物譜帶[流動方向以綠色箭頭表示]。圖4A代表零時[進樣時]的管柱，此時樣品進入管柱並開始形成譜帶。此處顯示的樣品是黃色、紅色和藍色染料的混合物，在管柱進樣端顯示為一條黑色譜帶。

幾分鐘後，移動相連續穩定地流過填充顆粒，可以看到各染料以不同的速度在不同的譜帶中移動[圖4B]。這是因為移動相和固定相之間對每種染料或分析物存在吸引競爭。注意看，黃色染料譜帶移動最快，即將離開管柱。黃色染料對移動相的親和力[容易被吸引]高於其他染料。因此，它的移動速度更快，更接近移動相的移動速度。藍色染料譜帶對填充材料的親和力高於移動相。它對顆粒的吸引力更強，導致移動速度明顯變慢。換言之，它是該樣品混合物中滯留性最強的化合物。紅色染料譜帶對移動相的吸引力中等，因此會以中等速度通過管柱。由於每個染料譜帶各以不同的速度移動，所以能透過層析分離法將混合物分離。

層析譜帶是如何變成波峰的

每個特定的分析物譜帶由許多分析物分子組成。譜帶中心含有最高濃度的分析物分子；而譜帶前緣和後緣的濃度會隨著與移動相交界而逐漸降低[圖5]。

當分離的染料譜帶離開管柱後，隨即就會進入偵測器。偵測器會在移動相背景下看到[偵測]每個分離化合物的譜帶[請見圖6]。合適的偵測器[UV、ELS、螢光、質量等]能夠感應化合物的存在，並向電腦數據站發出對應的電子訊號，然後在其中記錄成波峰。偵測器會依據譜帶內特定分析物分子的不同濃度發出訊號值，其中譜帶中心[分析物分子最密集處]會由偵測器解讀為波峰頂點。

什麼是層析圖？

層析圖表示的是HPLC系統中發生的化學[層析]分離。時間軸上繪有從基線升起的一系列波峰。每個波峰代表不同化合物的偵測器反應。層析圖由電腦數據站繪製[請見圖6]。黃色譜帶已完全通過偵測器流體槽，產生的電子訊號被傳送到電腦數據站。螢幕上開始出現產生的層析圖。請注意，層析圖從一開始進樣就開始出現，顯示為螢幕底部附近的一條直線。這條直線稱為基線，代表隨時間通過流體槽的純移動相。當黃色分析物譜帶通過流體槽時，會向電腦發出一種訊號[視分析物分子的濃度而異]。曲線先上升再下降，與樣品譜帶中黃色染料的濃度成正比。於是就在層析圖中形成一個波峰。待黃色譜帶完全通過偵測器流體槽後，訊號水平恢復到基線；現在，流體槽又回到只有純移動相的狀態。由於黃色譜帶移動最快，最先從管柱中洗脫出來，因此是第一個繪製的波峰。過了一會兒之後，紅色譜帶抵達流體槽。紅色譜帶一進入偵測器流體槽，訊號就會從基線上升，開始繪製代表紅色譜帶的波峰。這張圖中，紅色譜帶尚未完全通過流體槽。如果此時中途停止，紅色譜帶/波峰就是圖中所示的狀態。由於大部分紅色譜帶已通過偵測器流體槽，因此已經繪出了大半波峰，如實線所示。如果繼續層析分離過程，紅色譜帶可完全通過流體槽，並完成紅色波峰的繪製[虛線]。藍色譜帶滯留性最強，會以最慢的速度移動，在紅色譜帶之後洗脫出來。如果繼續運作到底，完整的層析圖就如虛線所示。有趣的是，藍色波峰的寬度是最寬的，因為藍色分析物譜帶的寬度雖然在管柱上最窄，但是從管柱離開後會變得最寬。這是因為它通過填充床的速度更慢，需要更多時間[和移動相體積]才能完全洗脫。由於移動相會以固定速率連續流動，所以藍色譜帶會變寬、變稀。偵測器訊號值與譜帶濃度成比例，因此藍色波峰的高度較矮，但寬度較大。

譜帶擴散

樣品/分析物譜帶在抵達偵測器之前，會先通過層析分離系統的多個元件，導致層析分離譜帶畸變和展寬[圖7]。這種現像稱為譜帶擴散。當分析物譜帶變寬，產生的層析峰寬也會變大。譜帶變寬會造成稀釋效應，導致峰高降低，靈敏度和解析度也會有所損失。反之，若能最大限度減少譜帶擴散，層析分離譜帶就越窄，效率越高。層析峰越高、越窄，就越容易被偵測器偵測到，由於分析物譜帶更集中，靈敏度和解析度得以提升。因此，請務必瞭解影響譜帶擴散的因素，盡量減少並控制這些影響，藉此提高整體層析效能。

在層析分離系統中，管柱效應和柱外效應[管柱外的所有因素]都會造成譜帶擴散。柱外效應的來源包括注射量、進樣器和管柱之間的儀器流體路徑，以及管柱出口到偵測器[包括流體槽]的管路和其中所有連接點。譜帶擴散的管柱效應來源包括填充材料的粒徑大小、管柱內填充材料的填充程度，以及與移動相速度、分析物大小和幾何形狀有關的擴散特性。以上因素中各個因素的變異數(σ2)總和會影響波峰的寬度[圖8]。

為了大大提高液相層析的效能，必須減少柱外和管柱譜帶擴散的影響。ACQUITY UPLC系統就是依據這個概念，減少這兩種譜帶擴散的影響，進而提高效率和靈敏度[圖9]。

解決柱外[儀器]譜帶擴散問題

為了大大提高層析效能，我們在設計LC儀器時做了很多工程方面的努力，使其能適應小顆粒[sub-2 µm]填料產生的壓力，同時盡可能減少流路的分散性，進而讓分離管柱達到理論效能。不僅如此，在實驗室例行使用中，這款儀器也同樣是可靠、穩固和精確的分析工具。為了證明儀器設計的重要性，我們需要瞭解系統分散[儀器+管柱譜帶擴散]如何影響層析分離結果。

平板計數[N]或效率的量測要考慮到波峰的分散情況。峰寬與分析物譜帶通過偵測器時的寬度直接相關，而峰頂點是分析物分子在該譜帶內濃度的最高點。這項量測在等度條件下進行。

平板計數方程式的推導如圖10所示，其中[Vn]是波峰的沖堤量，[w]是峰寬，[a]是一個常數，取決於所測峰寬處的峰高。只要波峰完全對稱，每種量測峰寬的方法都會產生相同的平板計數結果。如果波峰出現任何前沿或拖尾，這些量測方法將產生不同的結果。

有一個常見的誤解，就是平板計數只代表管柱本身達到的效能。但實際上，管柱和儀器的譜帶擴散也會影響到測定平板計數所依據的峰寬。為了證明儀器本身對譜帶擴散的影響，我們在兩台不同的儀器上使用同一支HPLC管柱執行分析：分別是標準HPLC[譜帶擴散=7.2 µL]和ACQUITY UPLC系統[譜帶擴散=2.8 µL]。由於是在兩個系統上使用相同的管柱，因此管柱的譜帶擴散作用保持不變。在ACQUITY UPLC系統上觀測到效率提高，證明譜帶擴散較少的儀器可以產生較窄的峰寬，平板計數更高[圖11]。

管路長度和直徑的影響

樣品譜帶引進液體流後就會進入管柱。ACQUITY UPLC樣品管理器的用途是盡量縮短進樣器和管柱進樣端之間的距離，最大限度減少譜帶擴散。管柱會將樣品譜帶分離成單獨的分析物譜帶，經過層析分離的分析物譜帶會從管柱轉移到偵測器。乍看之下，連接管柱出口和偵測器入口的管路內徑[ID]也許不太重要，但它卻能大大影響儀器譜帶擴散[圖12]。

正如所料，譜帶擴散會隨著管路內徑變小而減少。將濃縮的分析物譜帶流入內徑大的管路中，譜帶濃度會降低，造成波峰變寬且變形，靈敏度降低。不僅如此，管壁摩擦力還會導致與管壁接觸的分析物分子比管路中央的分子移動得更慢，引起譜帶分布圖變形。分析物譜帶中心和外緣之間的距離會隨著管路內徑變小而縮短，這會減小譜帶變形程度。盡量縮短管路長度也同樣重要，因為管路過長也會讓樣品譜帶變形。

偵測器設定對柱外譜帶擴散的影響

除了儀器流體式的譜帶擴散作用之外，與擷取速度和濾波器常數相關的數位偵測器設定也會影響層析分離結果。這在UPLC應用上尤其重要，因為這類應用的峰寬通常非常窄[寬1-2秒]，分析時間可能也極為短促。在設定偵測器的擷取速度時，應以在一個波峰上採集到足夠數據點的標準來選擇，才能正確表示波峰。偵測器速率設定得太高會對訊噪比產生負面影響，導致基線雜訊增加，而相關分析物的訊號高度卻沒有增加。反之，偵測器擷取速率設定得太慢會導致波峰上的數據點不足，降低觀測到的層析分離效率，減弱可重複執行定量的能力。此外，時間常數[數位濾波器]可用於平滑數據點，以達到最佳的訊噪比，並能與擷取速度結合使用或獨立使用。

隨著分析物譜帶的寬度變窄，偵測器設定變得越來越重要。因此，擷取速度不僅要快到能以數位方式形成該速度的波峰，若有相鄰洗脫峰，還要正確呈現UPLC管柱所達到的高解析度分離效能。

在流速較慢的情況下，波峰在時間上會更分散，這些設定的作用不是很大。可是，隨著波峰變窄和分析速度加快[如UPLC分離]，擷取速度和時間常數的設定就必須要聰明拿捏[圖13]。將UPLC技術用於「實際」應用時，聰明的做法是，選擇能準確擷取最窄波峰之峰型的偵測器數據擷取速率[Hz]，然後應用可為分析提供最佳訊噪比與解析度的濾波器時間常數[s]。