GPC 기초 화학

크기 분리 소개

크기 배제 크로마토그래피(SEC)라고도 하는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)는 모든 액체 크로마토그래피 기술 중에서 가장 이해하기 쉬운 방법입니다. 분리는 용액 내 샘플의 크기에 기반하여 엄격히 이루어지며 기존 HPLC와 달리 컬럼 충전제와의 상호작용(흡착, 분할 등)이 없습니다. 분리 모드는 분자량이 아니라 용액에서 분석되는 물질(일반적으로 폴리머)의 크기를 기반으로 합니다. 즉, GPC를 올바르게 수행하려면 샘플을 적절한 용매에 용해시켜야 합니다.

용액 내 샘플의 농도는 분자량에 따라 다르지만 분자량이 약 100,000인 폴리머의 경우 0.10%(w/v) 농도가 일반적입니다. (아래 샘플 전처리 섹션에서 자세한 내용을 참조하십시오.) 때로 샘플을 용해시키기 위해 샘플 용액을 가열하기도 합니다. 예를 들어, 일부 polyolefin은 용해를 위해 120°C 이상의 온도가 필요하며 일반적으로 140°C의 1,2,4 trichlorobenzene에서 실행됩니다.

적절하게 용해시킨 샘플은 주입 장치를 통해 분자 필터링 시스템의 역할을 하는 일련의 컬럼에 주입합니다. 컬럼은 표면 공극을 포함하는 가교 겔(예: 유기 응용 분야의 경우 styrene/divinylbenzene 공중합체)로 충전되어 있습니다. 이러한 공극은 작은 것에서 큰 것까지 다양할 수 있으며 위에서 언급한 분자 필터의 역할을 합니다. 더 큰 분자는 작은 공극에 맞지 않습니다. 반대로, 작은 분자는 대부분의 공극에 들어가고 더 오래 머무릅니다.

수십 년 전에 Waters가 수행한 최초의 GPC 데모 중 하나는 츄잉껌을 대상으로 한 것입니다. 츄잉껌은 실제로 합성고무에 향료, 안정화제 등과 같은 첨가제를 넣은 것입니다.

다음은 원래 GPC 크로마토그램을 직렬로 연결된 다양한 공극 크기의 여러 컬럼에서 분리시킨 것입니다. 폴리머(이 경우 고무)는 가장 큰 분자이기 때문에 먼저 용리되고 크기가 감소하는 순서로 "첨가제"가 용리됩니다. 가소제, 항산화제 및 UV 안정화제가 혼합된 PVC의 크로마토그램도 마찬가지일 수 있습니다.

단량체, 올리고머, 폴리머 및 분자량 분포

단량체는 단일 분자량을 가지며 단분산(monodisperse)이라고 합니다. 예로는 ethylene, styrene, vinyl chloride 등이 있습니다. 단량체 다음에는 올리고머(oligomer)라고 하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등이 있습니다. 분자량이 높아질수록 이 그룹을 폴리머라고 합니다. 폴리머는 사슬 길이, 즉 분자량의 분포를 가집니다. 중합이 어떻게 이루어졌는지에 따라 이 분포는 좁거나 상당히 넓을 수 있습니다. 예를 들어, polyester(polyethyleneterephthalate)와 같은 축합 또는 단계적 성장 중합체는 분자량 분포가 상당히 좁습니다. 다른 한편으로, 자유 라디칼 중합은 사슬 길이와 분자량의 매우 광범위한 분포를 갖는 폴리머를 생성할 수 있습니다(예: polyolefin의 경우). 중합의 동력학을 제어하는​것은 원하는 분자량 분포를 얻는 데 매우 중요합니다. GPC가 폴리머 화학자에게 중요한 기술인 이유가 여기에 있습니다.

다음은 한 폴리머(이 경우 polystyrene)의 두 분자량 분포를 겹쳐 놓은 모습입니다:

폴리머 샘플의 분자량 분포를 얻은 후에는 이를 정량화할 방법이 필요합니다. 단순히 통계를 수행하여 전체 분포의 분자량 평균을 할당합니다. 각 슬라이스에는 높이(Hi, 농도 Ci로도 표시됨), 머무름 시간 및 분자량(Mi) 속성이 부여됩니다. 분자량은 검량선으로부터 얻습니다(다음 섹션 참조). 다음으로, 합산을 수행하여 폴리머 분자량 분포를 설명하는 다양한 분자량 평균을 얻습니다. 표시된 PD는 중량 평균 및 수 평균 분자량의 비율이며 다분산도(polydispersity), 또는 간단히 폴리머의 분산도라고 합니다. 이 합산은 이러한 4가지 분자량 통계적 모멘트를 얻고 분자량 분포를 설명하는 간단한 방법입니다.

이러한 분자량 평균을 얻는 다른 기법이 있습니다.

• 수 평균, Mn은 막 삼투압 측정법 또는 말단기 분석(적정, NMR 등)으로도 얻을 수 있습니다.
• 중량 평균, Mw는 광산란으로 얻을 수 있습니다.
• Z 평균, Mz 및 Z + 1 평균, Mz + 1은 초원심분리(ultracentrifugation)로 얻을 수 있습니다.

GPC 시스템을 검량한 후, 한 번의 주입으로 이러한 모든 평균을 얻을 수 있습니다.

GPC 시스템 구성

이제 분자량 평균이 무엇인지 이해했으므로 시스템을 구성할 준비가 되었습니다.

시스템(위에 표시됨)은 펌프, 수동 또는 자동 방식의 주입기, 컬럼 세트, 검출기 및 일종의 데이터 처리 장치로 구성됩니다. 또한, 특히 굴절률 검출기와 함께 THF를 사용할 경우에 탈기 장치를 사용하는 것이 좋습니다. 컬럼은 낮은 압력 강하와 균일한 점도를 보장하기 위해 실온 용해하는 경우에도 거의 항상 일정 수준으로 온도를 상승시킵니다. 이제 시스템에 대해 더 자세히 설명하겠습니다.

용매 관리

오늘날 Waters GPC 시스템과 함께 사용되는 펌프는 매우 정교한 유체 처리 장치입니다. Alliance 시스템에서 사용되는 유체공학 시스템의 경우 실제로는 Solvent Manager입니다. GPC 분석을 위한 유체공학 모듈을 선택할 때 고려해야 할 가장 중요한 사항은 흐름 정밀도입니다. 시스템 검량은 분자량의 로그에 대한 머무름 시간(또는 부피)의 관계를 그래프로 나타낸 것입니다. 흐름에 약간의 변동만 생겨도 분자량의 큰 오차로 이어질 수 있습니다. 따라서 정밀한 유체 처리 장치를 사용하여 정확한 결과를 얻어야 합니다. 그러면 여전히 사용 중인 기존의 일부 저유량 정밀 펌프에 비해 분자량 평균 측정의 정확도가 크게 향상됩니다. Alliance 시스템과 함께 Solvent Manager를 사용하면 유량 보정 없이도 흐름 정밀도가 0.075% 이하로 현저히 낮춰집니다! 시판 중인 일부 펌프도 유사한 흐름 정밀도를 가진 것으로 주장되지만 소프트웨어 유량 보정을 적용했을 경우의 이야기입니다. GPC 시스템을 함께 구성하는 경우 0.3%(또는 더 나쁜)의 사양을 제공하는 시판 펌프에 주의를 기울여야 합니다.

Alliance 시스템 Solvent Manager는 또한 뛰어난 그래디언트 및 흐름 프로그램 성능을 제공합니다. 많은 폴리머 특성화 화학자들은 폴리머의 분자량 분포를 결정하는 외에도 첨가제 패키지를 분석하는 것이 얼마나 중요한지 잘 알고 있습니다. 많은 경우에 첨가제 패키지는 제품을 제조하는 데 사용된 폴리머만큼 완제품의 성공적인 응용과 관련성이 큽니다. 기본 제형에 첨가제의 배합 오류(예: 잘못된 산화 방지제 또는 잘못된 농도의 가소제)가 생기면 허용할 수 없는 물리적 특성 및 성능의 저하를 초래할 수 있습니다. 첨가제 패키지를 성공적으로 특성화하기 위해 역상 그래디언트 HPLC 분석이 수행됩니다. 폴리머 첨가제 외에도 에폭시 및 페놀 레진을 GPC(올리고머 분포 조사)와 그래디언트 HPLC(이성질체 및 불순물 특성화)를 이용해 정기적으로 분석합니다. Alliance 시스템을 사용하면 단일 시스템으로 고성능 GPC와 그래디언트 분석을 모두 수행할 수 있습니다.

샘플 관리

시스템 구성의 다음 단계는 분리를 위해 표준물질과 샘플을 도입할 방법을 결정하는 것입니다. 가장 저렴한 방법은 수동 주입기를 사용하는 것입니다. 수동으로 루프(알려진 부피)를 채우고 밸브를 열어 용리액이 흐르는 컬럼 세트 내로 용액을 흘려보냅니다. 이따금 몇 개의 샘플만 실행하는 경우에는 이 방법이 좋습니다. 그러나 매일 여러 개의 샘플을 처리하는 경우에는 자동 샘플러 사용을 고려하는 것이 더 나을 수 있습니다.

오늘날 실온 GPC 분석에 가장 많이 사용되는 Autosampler는 2707 Autosampler입니다. 완전 전동식인 이 Autosampler를 사용하면 전체 트레이에 샘플을 채우고 분석에 필요한 시간 동안 무인 상태로 실행할 수 있습니다. 이 샘플러는 주입량의 정확도와 재현성에서 최고 수준을 자랑하며, 로딩된 exact mass를 파악해야 하는 분자량에 민감한 검출기 질량 측정(예: 점도계 또는 광산란 검출기 사용 시)에 대단히 효과적입니다. Autosampler의 또 다른 옵션은 Alliance 시스템입니다. 5개의 서로 다른 캐러셀이 있으며 각 캐러셀에는 최대 24개의 샘플(총 120개의 샘플 용량)이 들어갑니다.

컬럼 선택

폴리머를 용해시키는 데 적합한 용매를 찾고 올바른 농도의 내로우(Narrow) 표준물질과 샘플을 준비했으므로 이제 분석을 시작할 준비가 되었습니다. 분석을 수행하기 위한 올바른 컬럼 세트를 선택했으므로 이제 시작할 준비가 되었습니다. 그러나 올바른 컬럼 세트를 선택하는 절차를 검토해 보겠습니다.

많은 사람들이 "확장 범위" 또는 "혼합 베드" 컬럼이라고도 하는 "선형" 컬럼을 사용하려는 경향이 있습니다. 이러한 컬럼에는 다양한 공극 크기가 혼합되어 있는데, 단일 공극 크기의 컬럼보다 더 넓은 분자량 범위를 지원하려는 것이 그 목적입니다. 충분히 주의를 기울여 공극을 혼합한다면 컬럼 검량선은 선형이 될 수 있습니다.

이러한 혼합 베드 컬럼을 사용할 때의 단점은 개별 공극 크기의 컬럼을 사용할 때보다 유한한 분자 범위에서 분리능이 낮다는 것입니다. 예를 들어, 분자량 범위가 수백에서 5천 사이인 일련의 에폭시 또는 페놀 레진을 분석하는 경우 어떤 컬럼 세트를 사용하시겠습니까? 첫 번째 고려할 사항은 컬럼 세트의 공극 부피가 올바른 분리,   즉 폴리머의 올바른 분포 프로파일을 얻기에 충분해야 한다는 것입니다. 하나의 컬럼으로는 확실히 충분하지 않고, 두 개도 여전히 충분하지 않을 수 있습니다. 성공적인 분리를 얻기에 충분한 공극 부피를 보장하려면 최소 세 개의 컬럼을 직렬로 사용해야 합니다.

이제, 에폭시 또는 페놀 레진을 분석하기 위해서는 어떤 컬럼을 사용해야 할까요? 공극 크기가 혼합된 "혼합 베드" 컬럼 세트를 사용해야 할까요? 아니면 관심 분자량 범위만을 타겟으로 하는 일련의 개별 공극 크기 컬럼을 사용해야 할까요? 다음 표에는 polystyrene 사슬 길이 배제 한계(옹스트롬 단위)를 기반으로, styrene/divinylbenzene 충전의 개별 공극 크기 컬럼에 대한 분리 분자량 범위가 나와 있습니다.

컬럼에 대해 한 마디 더 보태자면, GPC 용매 가이드를 살펴보면 일반적인 작동 온도 범위가 표시되어 있음을 알 수 있습니다. GPC 분석에서 우리는 거의 항상 용매 가이드에 표시된 대로 약간 높은 온도로 컬럼을 가열합니다(실온 응용의 경우에도). 컬럼을 가열하는 목적은 용해 때문이 아니라 분리의 분리능을 높이고 투과 과정을 향상시키며, 경우에 따라 용매(예: DMF)의 점도를 낮추고 전체 컬럼 뱅크에 걸쳐 역압을 줄이기 위한 것입니다. 

검출기 옵션

오늘날 GPC 분석에 가장 널리 사용되는 검출기는 차등 굴절계입니다. 이 검출기는 기준 측의 용리액과 샘플 측의 샘플+용리액 사이의 굴절률(dRI) 차이를 측정하는 간단한 원리로 작동하는 농도 감응형 검출기입니다. 용리액과 비교하여 굴절률에 상당한 차이가 있는 어떤 폴리머에 대해서도 반응을 얻을 수 있다는 점에서 (예를 들어, UV 검출기와 달리) "범용" 검출기입니다. 경우에 따라 샘플 및 용리액(예: 실리콘 및 THF)에 대한 dRI가 매우 작아 신호가 불량할 수 있습니다. 이 경우 폴리머를 용해하고 상당한 dRI를 제공하는 다른 용리액을 찾아야 합니다. Waters 2414 굴절계(및 이전 모델 2410 및 410)는 수년 동안 업계 표준이었습니다.

GPC에 자주 사용되는 또 다른 검출기는 UV 검출기입니다. 물론, 신호를 얻기 위해 UV를 흡수할 발색단이 있어야 합니다. UV 검출기는 styrene계 폴리머(polystyrene, styrene/isoprene, styrene/butadiene, ABS 등), 에폭시, 페놀, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 방향족 폴리에스터 등에 탁월합니다. 그래디언트 분석을 수행하는 경우(실행 전체에 걸쳐 용매 조성이 변화함) UV 검출기를 사용해야 합니다. RI 검출기는 용리액 조성의 변화에 따라 표류가 계속 발생하기 때문입니다. Waters 2489 UV 검출기는 UV 흡수 폴리머 및 첨가제의 GPC/HPLC 분석에서 탁월한 감도, 직선성 및 전반적으로 뛰어난 성능을 제공합니다.  

UV에서 한 단계 업그레이드된 강력하고 정보가 풍부한 검출기인 광다이오드 어레이(PDA) 검출기도 사용할 수 있습니다. 이 검출기에는 광다이오드 어레이가 사용되어 다양한 파장을 즉시 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 대부분의 UV 검출기에서와 같이 단지 하나 또는 두 개의 파장을 확인하는 대신 190~800나노미터(nm) 파장 범위를 확인하도록 PDA를 설정할 수 있습니다. 이제 폴리머 샘플(또는 첨가제)에 대한 실제 UV 스펙트럼을 살펴볼 수 있습니다. 이를 통해 화학 조성 분포에 대한 결정을 내릴 수 있습니다. 예를 들어 SBR(styrene/butadiene 고무)이 블록 또는 무작위 공중합체인지 결정할 수 있습니다. 미지의 샘플을 비교할 수 있는 스펙트럼 라이브러리를 만들 수 있습니다. 이 작업은 폴리머 또는 폴리머 첨가제에 대해 수행할 수 있습니다. 이제 합성된 완제품에 어떤 첨가제가 존재하는지 확인해 볼 수 있습니다. PDA는 경쟁 화합물을 비제형화하는 데도 사용할 수 있습니다.  

폴리머 특성화 화학자들이 샘플에 대해 최대한 많은 것을 알아내기 위해 노력함에 따라 다른 검출 옵션도 고려되고 있습니다. 우리는 GPC 분석을 위한 "고급" 검출의 세계로 나아감에 따라 점차적으로 점도 측정 및 광산란과 같은 분자량에 민감한 검출기를 고려하기 시작했습니다. 점도계 검출기는 이어지는 검량 섹션에서 자세히 설명하겠습니다. 본질적으로, 점도계 검출기를 굴절계와 나란히 배치하면 폴리머의 고유 점도[h]뿐만 아니라 "절대" 분자량 및 긴 사슬 가지치기 추정도 얻을 수 있습니다. RI 검출기는 농도 검출기(C)이고 점도계는 [h](C)를 제공합니다. 두 신호를 직렬로 사용하면 폴리머의 전체 용리 프로파일에 걸쳐 각 슬라이스의 고유 점도를 얻을 수 있습니다. 그런 다음, 다음 섹션에서 설명하는 Benoit의 범용 검량(Universal Calibration) 개념을 사용하여 폴리머 샘플의 절대 분자량을 얻을 수 있습니다.  

굴절계와 결합된 광산란 검출기는 GPC 분석을 위한 또 다른 강력한 고급 검출 모드입니다. 기본적으로 레이저 빔이 샘플 용액이 포함된 셀(이 경우 온라인)에 집중됩니다. 입사 광선은 용액에 있는 폴리머 입자에 의해 산란됩니다. 광산란 검출기의 설계(작은 각도 또는 다중 각도)에 따라 중량 평균 분자량 Mw는 용액에서 폴리머의 회전 반경 결과의 유무에 관계없이 정확하게 측정할 수 있습니다.  

RI가 직렬로 구성된 점도계와 광산란 검출기의 두 경우 모두에서 매우 유용한 정보를 많이 얻을 수 있습니다. 삼중 검출기 접근 방식을 사용하면 사용자가 모든 것을 해석할 수만 있다면 매우 의미 있는 데이터가 얻어집니다. 다중 검출기 데이터 축소에 대한 자세한 내용은 참조 섹션을 참조하십시오.  

질량분석기와 같이 폴리머 및 첨가제의 고급 검출을 위한 다른 기술이 존재하지만 오늘날 GPC 분석에 사용되는 일반적인 검출기는 RI, UV/PDA, 점도계 및 광산란입니다.

데이터 처리

시스템의 주요 하드웨어 부분을 구성했으면 이제 이 시스템을 제어하고 데이터를 프로세싱하기 위한 소프트웨어 옵션을 고려해야 합니다. 오늘날 보급되어 있는 매우 강력한 컴퓨터를 사용하면 검량 및 분자량 분포 계산을 몇 초 만에 완료할 수 있습니다. Empower 소프트웨어는 기존 GPC(RI 전용) 데이터 감소와 RI/점도 측정 모두에 사용할 수 있습니다. Empower 2는 상대 검량(Relative Calibration), 누적 일치(Cumulative Matching) 및 Hamielec 브로드 표준물질 검량(Hamielec Broad Standard Calibration), 범용 검량(Universal Calibration)을 포함한 많은 검량 절차를 지원합니다. 고유한 경계 검량(Bounded Calibration) 및 스플라인 맞춤과 함께 0~5차 곡선 맞춤이 모두 지원됩니다.