분취용 SFC에 대한 입문자 가이드

분석법 고려 사항

분석법을 정제 목적으로 스케일 업할 경우 크로마토그래피가 해당 응용 분야에 가장 적합해야 합니다. 분석 스케일에서 보다 나은 분리능은 분취용 스케일에서 보다 나은 크로마토그래피로 이어져, 결과적으로 더 빠른 처리량과 보다 순수한 분획물을 생성할 수 있게 됩니다. 분석법에는 컬럼 가열, 주입 모드, 압력 강하, 시스템 압력 및 컬럼 일치와 같은 분취용 기술의 조건 또한 고려되어야 합니다. 정제 과정이 MS에 의한 것이라면, 분석 스케일의 모든 선별 검사와 분석법 개발 또한 MS 검출을 사용하여 수행되어야 합니다. 그래디언트 분석법의 경우 그래디언트 기울기와 평형 시간은 분석용 시스템과 분취용 시스템 간의 부피 차이를 고려해야 합니다. 분석적 로딩은 혼합 스트림 주입을 사용하여 수행되는 경우가 많은 반면, 분취법은 변형제 스트림 주입을 사용하기 때문에 희석 효과 또한 고려해야 합니다.

로딩

주입 전략의 차이를 유념하여 로딩 연구는 일반적으로 작은(분석적) 스케일에서 먼저 수행됩니다. 시스템에 도입하기 전에 샘플의 화합물 용해도를 파악하는 것이 중요합니다. 분취용 응용 분야의 가장 좋은 점은 가장 적은 양의 용매에 많은 양의 샘플을 로딩할 수 있다는 것입니다(고농도 샘플). 그러나 샘플은 CO₂와 결합되어 유기 이동상에 도입된 후에도 용액에 남아 있어야 합니다. 허용 가능한 농도가 결정되면, 분리능이 상실될 때까지 주입 부피가 점진적으로 증가하거나, 더 이상 표적 화합물의 순수한 분획물을 얻기 위해 크로마토그래피를 사용할 수 없는 경우 샘플 로딩 연구가 수행됩니다.

성공적인 스케일링에 대한 일반적인 요건

허용 가능한 분석법이 개발되고 분석 스케일로 로딩 연구가 수행되면, 스케일 업할 때 머무름과 선택성을 동일(또는 유사)하게 유지하는 것이 이상적입니다. 크로마토그래피 스케일을 성공적으로 조정하기 위해서는 몇 가지 변수가 일정하게 유지되어야 합니다.

■ 이동상은 동일해야 합니다. SFC에서 이는 동일한 보조 용매(co-solvent)(용매 B)를 의미하며, CO₂는 품질, Inlet 압력, 물리적 상태(액체 또는 기체) 및 전달법이 유사해야 합니다.

■ 여러 가지 규모에서 크로마토그래피 일관성을 유지하기 위해 컬럼의 케미스트리, 길이, 입자 크기가 동일해야 합니다. 작은 입자 크기의 컬럼을 분석 스케일로 사용하는 경우, 컬럼 간 길이 대 입자 크기 비율(L/dp)이 동일해야 합니다.

■ 샘플은 동일한 농도여야 하며, 동일한 희석액을 용해시켜야 합니다.

기하학적 스케일링

분취용 SFC의 경우 LC와 마찬가지로 주입 부피(로딩)와 유속이 기하학적으로 조정됩니다.

피크 모양과 로딩 용량을 유지하려면 주입 부피를 컬럼 크기에 맞게 적절히 조정해야 합니다. 용량은 다음 방정식에 의해 결정됩니다.

여기서 Vol은 주입 부피(μL), D는 컬럼 내경(mm), L은 컬럼 길이(mm)를 나타냅니다.

마찬가지로, 분리 품질을 유지하기 위해 유속은 컬럼 규격에 따라 조정됩니다. 동일한 길이와 입자 크기의 컬럼에서 유속의 기하학적 스케일링은 다음과 같습니다.

여기서 F는 유속(mL/분), D는 컬럼 내경(mm)을 나타냅니다.

드웰부피(dwell volume) 및 엑스트라 컬럼 볼륨

컬럼의 길이가 동일할 경우, 드웰부피(dwell volume)를 기준으로 분취법의 그래디언트 프로파일을 변경해야 합니다. 이러한 조정을 수행하려면 분석용 시스템 및 분취용 시스템 모두에 대해 드웰부피(dwell volume)를 측정해야 합니다. 드웰부피(dwell volume)를 측정하기 위해서는 일반적으로 UV 신호를 제공하는 화합물 또는 용매를 보조 용매(co-solvent)에 첨가하고 컬럼 없이 그래디언트를 실행합니다. 펌프에서 그래디언트 시작과 검출기의 신호 변화 간의 지연 시간에 기초하여, 드웰부피(dwell volume)는 지연 시간에 유속을 곱하여 측정할 수 있습니다(그림 25).

또한 최종 크로마토그래피에서 띠 넓어짐 현상을 초래할 수 있는 튜브, 주입 밸브, 루프 크기, 검출기 플로우 셀, 분할기와 같은 엑스트라 컬럼 볼륨의 영향을 확인하는 것이 중요합니다. 엑스트라 컬럼 볼륨 및 띠 넓어짐 현상을 측정하기 위해 컬럼을 제거한 후 주입을 진행합니다. 주입과 검출 간의 시간을 유속에 곱한 값은 엑스트라 컬럼 볼륨과 같습니다. 컬럼이 없는 피크 모양은 엑스트라 컬럼 볼륨의 결과로 발생하는 모든 넓어짐 현상을 나타냅니다. 시스템에 변형제 스트림 주입을 위한 배관이 되어 있었기 때문에, 100% 보조 용매(co-solvent)로 주입이 이루어졌으므로 CO₂ 사후 주입을 추가하지 않고 보다 정확하게 부피를 측정할 수 있었습니다. 이 절차에 대한 자세한 내용은 www.waters.com에서 액세스할 수 있는 온라인 애플리케이션인 “분취용 OBD 컬럼 계산기”에 포함되어 있습니다. 컬럼 계산기는 모든 분석용/분취용 스케일링 계산에 도움을 주는 사용이 간편한 도구입니다.

이동상 밀도 고려 사항

LC에 대한 간단한 스케일 업 규칙이 SFC에 적용되지만 이동상의 일정한 밀도를 가정하기 때문에 직접 적용할 수 없습니다. SFC의 스케일 업은 보다 복잡하며, 이는 주로 컬럼과 시스템 간에 밀도, 압력, 온도 변화를 일으키는 이동상의 압축성 때문입니다. 이러한 요인의 변화는 이동상 조성과 강도에 영향을 주게 됩니다. 머무름 및 선택성에 대해 생성되는 효과는 분석 스케일 시스템과 분취 스케일 시스템 간의 분리 프로파일을 유지하는 것을 더욱 어렵게 합니다.

밀도와 온도 변화는 직접 제어할 수 없지만, 크로마토그래피는 SFC에서 다음과 같은 분석법 변수를 조정하여 다양한 스케일에서 일관성을 유지할 수 있습니다.

■ 시스템 간의 평균 압력(따라서 평균 밀도)의 일치. 평균 압력은 정압과 역압을 합하여 2로 나눈 값과 같습니다. 압력은 컬럼 전체에 걸쳐 유사한 압력(밀도) 프로파일을 유지하기 위해 분석용 기기 또는 분취용 기기에서 자동 압력 조정기 설정을 변경하여 일치시킬 수 있습니다. 평균 압력이 일치한다고 해서 밀도 프로파일이 항상 일치하는 것은 아니지만 프로파일은 보다 나은 수치를 제공한다는 점에 유의해야 합니다.

■ 이산화탄소와 보조 용매(co-solvent)에 대한 이동상 조성의 정확한 일치. 이는 기본적으로 부피 흐름에서 질량 흐름(분석상) 또는 질량 흐름에서 부피 흐름(분취상)으로 동일한 이동상을 구성하도록 하는 시스템 간의 단위 변환입니다.

SFC에서 보조 용매(co-solvent) 조성은 피크 머무름을 제어하는 가장 중요한 변수입니다. 결과적으로, 보조 용매(co-solvent) 조성의 정확한 스케일링은 분석법에 대한 스케일 업에 필수적입니다. CO₂ 및 보조 용매(co-solvent)의 질량 흐름과 조성을 컬럼 Outlet 압력 및 온도와 함께 일치시킴으로써, 부피 흐름을 기반으로 하는 기기에서 질량 흐름을 기반으로 하는 기기로 안정적인 스케일 업이 가능해집니다.

스케일 업 예시

이 예시에서 분석법은 다음과 같은 파라미터를 사용하여 UPC² 시스템에서 개발되었습니다(표 6).

컬럼 길이 및 입자 크기를 일정하게 유지하기 위해 5μm의 입자를 갖는 21 x 150mm Chiralpak IA 컬럼을 분취용 시스템에 사용하였습니다. 주입 부피는 기하학적으로 스케일링되었으므로 내경이 4.6mm인 컬럼의 10μL 주입은 내경이 21mm인 컬럼의 208μL 주입과 동일합니다. 이 경우, 분석용 시스템의 CO₂ 펌프는 부피 흐름 제어가 이루어졌으며, 분취용 시스템의 펌프는 질량 흐름 제어로 이루어졌습니다. 그 결과, 기하학적 스케일 업을 계산하기 전, 분석법 CO₂ 유속을 질량 흐름으로 변환해야 했습니다. 이는 다음 방정식을 사용하여 수행되었습니다.

■ CO₂ 흐름 = 2.67mL/분

■ CO₂ 밀도 = 0.89g/mL

■ CO₂ 흐름(질량) = CO₂ 흐름 x CO₂ 밀도

■ CO₂ 흐름(질량) = 0.89 x 2.67 = 2.38g/분

보조 용매(co-solvent)는 순조롭게 스케일링(mL~mL)되고, 보조 용매의 유속은 0.33mL/분이므로, 약 12%의 메탄올에서 총 분석적 유속은 2.70g/분을 나타냈습니다. 이러한 유속과 백분율을 기하학적으로 측정하여 12%의 보조 용매(co-solvent) 조건에서 21 x150mm 컬럼에 56g/분의 분취 유속이 계산되었습니다.

흐름과 조성이 측정되면 동일한 평균 압력을 사용하여 밀도 프로파일을 분석용 시스템에 일치시켜야 했습니다. 분석용 시스템의 정압은 162bar이고, 역압은 120bar(압력 강하는 42bar)이므로 평균 압력은 141bar로 계산되었습니다. 분취용 시스템의 압력 강하가 24bar였기 때문에 분석용 시스템의 평균 압력과 일치시키기 위하여 역압을 130bar로 설정해야 했습니다. 마지막으로, 온도 또한 35°C에서 일치시켰습니다. 이러한 파라미터를 사용한 ACQUITY UPC²에서 분취용 SFC 시스템을 이용한 분리로의 성공적인 스케일 업을 그림 26에서 볼 수 있습니다. 프로파일은 동일하지만 주입 전략의 차이로 인해 분취용 시스템의 머무름 시간이 다소 증가하였습니다. 분석용 시스템에는 혼합 스트림 주입을 사용하였고 분취용 시스템에는 변형제 스트림 주입을 사용하였습니다.

스택 주입

많은 응용 분야에서 스택 주입이 사용됩니다. 스택 주입은 주입 사이클 간의 시간과 용매 소비량을 줄입니다. 또한 스택 주입은 지속적인 분리 및 정제를 위해 사용 가능한 모든 크로마토그래피 공간을 활용함으로써 처리량을 폭넓게 향상시킵니다. 일반적으로 주입은 이미 주입된 샘플이 컬럼에 존재하는 동안(또는 컬럼에서 용리되는 동안) 이루어집니다. 따라서 스택 주입을 활용하기 위해서는 등용매 분석법이 필요합니다. 성공적인 스택 주입을 위해서는 올바른 사이클 시간(또는 주입 간 시간)을 결정해야 합니다. 또한 모든 피크 세트가 용리 및 수집되도록 순서의 마지막 주입에 대한 총 실행 시간이 필요합니다. 그림 27은 이러한 값이 결정되고 스택 주입 세트에 적용되는 방법을 보여줍니다. 사이클 시간은 총 실행 시간의 절반 정도이기 때문에 첫 번째 표적 피크가 용리를 시작하기 전에 두 번 주입됩니다. 마지막 주입이 수행된 후 두 세트의 피크가 용리되어 수집됩니다. 이 경우 스택 주입을 사용할 경우, 기존 단일 주입 분석에 비해 총 처리 시간이 절반으로 줄어듭니다.

예시 응용 분야

앞서 설명한 SFC의 선택성 범위가 확장되었으므로, 해당 기술은 다양한 용도에 적합합니다(표 7).

표 7. 마케팅 영역에서의 분취용 SFC 응용 분야.

마케팅 영역 또는 정제 목표와 관계없이 분취용 SFC는 다음을 제공합니다.

■ 사용하기 쉬운 단일 플랫폼에서의 다양한 선택성

■ 크로마토그래피 스케일링의 범위

■ 생산성 향상 및 용매 소비량 절감

■ 역상 LC에 대한 직교성

■ 구조적 유사성을 갖는 화합물의 분리 및 정제

이 섹션에서는 다양한 워크플로우 및 응용 분야를 소개하기 위해 예시 응용 분야의 발췌문을 인용하였습니다. 모든 응용 분야는 Waters 웹사이트 www.waters.com에서 확인하실 수 있습니다.

SFC에 의한 휘발성 향료의 키랄 정제

SFC의 주요 적용 영역 중 하나는 키랄 분리입니다. 키랄 약물의 거울상 이성질체가 다른 제약적 활성을 나타내듯이 향료 화합물의 입체화학은 맛, 향의 특성, 강도를 결정합니다. 이러한 화합물의 정제 과정은 휘발성으로 인해 상당히 어려울 수 있습니다. SFC는 키랄 향료 화합물의 높은 회수율을 위한 빠르고 낮은 온도 옵션을 제공합니다.

여기서 linalool과 terpinen-4-ol의 거울상 이성질체는 키랄 분취용 SFC에서 스택 주입을 사용해 라벤더와 티트리 에센셜 오일에서 각각 정제하였습니다. 그림 28은 4.6 x 250mm AD-H 컬럼의 분석법에서 반분취 10 x 250mm AD-H 컬럼으로의 스케일 업을 보여줍니다. 티트리 오일 분리에서는 terpinen-4-ol 거울상 이성질체가 모두 존재하는 반면, 라벤더 오일에는 linalool 거울상 이성질체 중 하나만 포함되어 있습니다. 분취용 SFC 분석법 파라미터는 표 8에 정리되어 있습니다.

등용매 분석법이므로, 스택 주입을 통해 분취 효율성을 향상시켰습니다. 크로마토그래피를 기반으로 사이클 시간은 티트리 오일은 약 3분, 라벤더 오일은 약 2분이었습니다. 스택 주입을 통한 키랄 정제 결과는 그림 29에서 볼 수 있습니다. 50Mg의 티트리 오일은 40분 이내에 처리되었으며, 30mg의 라벤더 오일은 30분 이내에 처리되었습니다.

3가지 분획물에 대한 순도가 92%를 초과하는 분취 분석이 그림 30에 나와 있습니다. 회수율 연구는 terpinen-4-ol과 linalool의 racemic 표준 물질을 사용하여 수행되었으며, 70-80%의 회수율을 보였습니다. 이는 일반적으로 보고된 회수율이 상당히 낮다는 점을 고려하면 인상적인 결과입니다.

MS 기반 분획 트리거를 이용한 제약 화합물의 아키랄 정제

UV에 의한 정제에서는 검출기를 통해 피크를 서로 구별할 수 없습니다. 많은 화합물이 같은 파장에서 흡수되기 때문입니다. 질량에 의한 정제는 질량을 기반으로 분획물을 수집하는데, 이는 표적과 불순물을 구별할 수 있기 때문에 보다 구체적인 파라미터가 됩니다. 활성 의약품 성분이 합성될 경우 최종 생성물과 함께 중간 불순물이 존재하는 경우가 있습니다.

Imatinib은 다양한 암 치료에 사용되는 티로신-키나제 억제제입니다. 여기서, 반응 중간체와 최종 생성물은 Imatinib의 합성을 위해 정제되었습니다. 첫 번째 단계에서, 혼합물은 세 가지 아키랄 컬럼과 메탄올을 사용하여 ammonium hydroxide 첨가물을 첨가하거나 첨가하지 않고 선별 검사를 진행하였습니다. 선별 검사의 결과는 그림 31에 나와 있습니다. BEH 2-EP 컬럼과 ammonium hydroxide가 포함된 메탄올은 최적화 및 스케일링을 위한 최적의 분석법 파라미터로 선택되었습니다.

스케일 업을 위한 분리를 향상하기 위해 중간체와 생성물에 대해 개별적으로 포커싱 그래디언트가 개발되었습니다. 용리 시 보조 용매(co-solvent) 농도는 선별 검사 그래디언트의 기울기와 각 관심 피크의 머무름 시간을 기준으로 계산하였습니다. 중간체는 14%의 보조 용매(co-solvent)에서 용리된 반면, 생성물은 29%의 보조 용매(co-solvent)에서 용리되었습니다. 2분간의 포커싱 그래디언트는 이러한 비율을 중심으로 개발되었으며, 시작 지점은 5% 더 낮고 최종 지점은 5% 더 높았습니다.

스케일 업의 경우 동일한 컬럼 케미스트리를 사용하였으며 길이 대 입자 크기(L/dp)의 비율을 일정하게 유지하였습니다. 입자가 1.7μm인 3 x 50mm 분석용 컬럼(L/dp = 29.4)은 입자가 5μm인 19 x 150mm 분취용 컬럼(L/dp = 30)으로 스케일링되었습니다. 스케일링된 크로마토그래피(집중) 및 질량에 의한 분취가 그림 32에 나와 있습니다.