초임계 유체 기술(SFx)은 SFC 기반 정제 과정의 기본적인 개념입니다. Waters SFx 기술에는 추출(SFE), 분석 크로마토그래피(UPC²), 분취용 크로마토그래피(분취용 SFC)가 있으며, 이 기술들은 모두 아임계 또는 초임계 CO₂를 일차 용매로 사용합니다. 액체 유기 용매와 수용성 용매를 CO₂로 대체함으로써, SFx 기술은 액체 기반의 정제에 대한 직교적이고 환경 친화적이며 비용 효율적인 대안을 제공합니다. SFx는 유기 용매 폐기물을 줄여주며 환경 발자국을 감소시켜 '친환경' 기술로 평가받고 있습니다. 이 기술은 LC 정제에 비해 속도와 선택성이 향상되어 복잡한 시작 물질에서 최종 산물로 진행되는 데 소요되는 시간과 비용을 대폭 절감해 줍니다. 최근 기기 기술의 발전으로 SFx 기술의 분리력은 현재 광범위한 정제 응용 분야에서 완전하게 실현되고 있습니다.

많은 물질은 초임계 상태에 도달하기 위해 극한 조건을 요하며, 초임계 상태가 될 경우 바람직하지 않은 특성을 나타냅니다. 표 1에는 선택된 일부 초임계 물질의 초임계 유체 조건 및 그에 수반되는 특성이 정리되어 있습니다. 다른 초임계 물질과 달리 CO₂는 인화성, 폭발성, 독성 또는 부식성이 없기 때문에 일반적으로 안전한 것으로 간주됩니다. CO₂의 초임계 상태는 쉽게 달성될 수 있으므로, 31°C 및 74bar에서는 허용 가능한 범위 내의 온도와 압력에서 밀도를 조절할 수 있습니다. 또한 상대적으로 낮은 임계 온도로 인해 열에 불안정한 샘플에 적합합니다. 또한 CO₂는 여러 산업 프로세스에서 쉽게 회수할 수 있기 때문에 상대적으로 저렴합니다. 이는 CO₂가 환경적 수준에 중립적인 영향을 미친다는 것을 의미합니다. 이러한 모든 이점으로 인해 CO₂는 초임계 유체 기술에 가장 일반적으로 사용되는 물질입니다.

정제 워크플로우는 응용 분야의 요건을 기반으로 복잡성과 필요성에 따라 다양한 단계로 구성됩니다. 기본 수준에서 SFx 정제 워크플로우에는 다음의 구성이 포함됩니다.

시작 물질 또는 샘플: 샘플은 자연적으로 발생하는 식물처럼 복잡할 수도 있고, 잘 특성화된 제약 후보처럼 비교적 단순할 수도 있습니다. 샘플 전처리가 필요한 경우 이에 따라 샘플 전처리에 요구되는 양과 정제 규모가 결정됩니다. 또한 열 안정성, 극성, 용해성 및 샘플을 처리하는 방법을 나타내는 반응성과 같이 샘플 및 최종 생성물에 대해 가능한 많은 정보가 있는 것이 좋습니다.

샘플 전처리: 정제 프로세스의 첫 단계로, 시작 물질의 상태와 해당 응용 분야의 목적 또는 범위에 따라 샘플을 적절하게 처리해야 합니다. 샘플 전처리 과정에서는 분쇄, 건조, 추출 및 여과, 또는 단순히 용액에 용해시키는 등의 여러 가지 단계를 진행할 수 있습니다. 초임계 유체 추출(SFE)은 SFx 워크플로우의 첫 번째 단계(샘플 전처리)입니다. 일반적으로 원시 산업 제품, 생물식물학 또는 천연물과 관련된 응용 분야에 사용됩니다.

샘플 정제: 정제법은 샘플의 복잡성을 줄이거나 최종 생성물을 분석 또는 제품 포뮬레이션을 위해 특정 순도 규격 이내로 분리하는 데 사용됩니다. SFE에 의해 전처리된 샘플은 일반적으로 표적 화합물 및 불순물을 포함하는 복합적인 혼합물입니다. SFx 워크플로우에서 분취용 초임계 유체 크로마토그래피(분취용 SFC)는 추출물에서 하나 또는 여러 표적을 정제하는 두 번째 단계(정제)입니다. 분취용 SFC는 SFE뿐만 아니라 다양한 방법을 통해 전처리된 샘플에도 적용할 수 있습니다.

최종 생성물: 최종 생성물은 워크플로우의 최종적인 목표 산물입니다. 이는 분석을 통해 생성된 데이터 및 정보, 프로세스에 사용되는 정제된 물질 또는 직접 활용이 가능한 최종 생성물이 될 수 있습니다. 최종 생성물은 성공적인 워크플로우에 필요한 기기와 방법론을 결정합니다. SFx 워크플로우에서 샘플 추출 전/후(SFE) 및 정제(분취용 SFC) 분석은 초고성능 융합 크로마토그래피(UPC²)를 통해 수행됩니다.

이러한 SFx 기술은 필요에 따라 SFx가 아닌 워크플로우에서 분취, 정제 또는 분석 단계로 활용할 수 있습니다.

분취용 고성능 액체 크로마토그래피(분취용 HPLC)는 20년 이상 정제 과정에 가장 많이 사용되는 기술 중 하나입니다. 특히 이는 제품의 정제 과정에 널리 사용되는 정밀 화학, 제약, 생명공학 산업에서 가장 대중적인 분리 프로세스입니다. 시간이 지남에 따라 분취용 HPLC는 특히 아키랄 정제 과정에 매우 효율적이고 응용 가능한 기술로 발전해 왔습니다. 역상 액체 크로마토그래피(RPLC)는 물과 아세토니트릴의 보편적인 고정상(C₁₈)과 일반적으로 응용 가능한 이동상 혼합물을 사용할 수 있는 이점이 있습니다. RPLC는 질량분석(MS)과 호환되며, MS(RPLC-MS)와 결합된 RPLC는 많은 연구 환경에서 정제 과정을 위한 표준적인 접근 방식이었습니다.

이러한 인기에도 불구하고, 분취용 HPLC에는 몇 가지 단점이 있습니다. 주어진 화합물의 질량을 정제하는 데 필요한 이동상의 부피가 처리되는 전체 샘플의 양에 비해 큽니다. 일반적인 분취용 HPLC 분획물은 많은 양의 용매(유기 용매와 수용성 용매 모두)를 포함하고 있으며, 최종 생성물을 건조하고 확보하는 데 필요한 시간과 에너지로 인해 생산성의 병목을 야기합니다.

LC에 사용되는 용매는 화학적 폐기물의 연소를 통해(증발 및 노출을 통해) 국지적으로나 전역적으로 환경을 오염시킬 수 있습니다. 순상 액체 크로마토그래피(NPLC)는 이동상이 일반적으로 100% 유기 용매로 구성되어 있기 때문에 훨씬 더 환경적으로 해로운 것으로 간주됩니다. 이러한 환경적 요인 때문에 LC에서 사용되는 용매의 수급 및 폐기에 점점 더 많은 비용에 투입되고 있으며, 이로 인해 용매가 없거나 친환경적인 프로세스를 위한 장려책이 요구됩니다. SFC는 병목 현상을 완화하고 작동 시간을 단축하며 용매 소비량을 줄이고 비용을 절감하는 운영상의 개선점을 가져올 수 있는 대안적인 기술입니다. 최근, SFC 기기의 발전은 키랄과 아키랄 정제를 위한 견고한 도구로서 이 기술에 대한 새로운 관심을 불러일으켰습니다. SFC는 분석과 정제를 위한 HPLC의 ‘친환경적인’ 대안입니다.

초임계 유체 크로마토그래피(SFC)는 주로 유기 용매를 동반하는 이동상에서 아임계(액체)와 초임계 CO₂를 일차 용매로 사용하는 크로마토그래피 기술입니다. 모든 크로마토그래피와 마찬가지로 SFC는 고정상(컬럼)과 이동상(용매) 사이의 분석물 분할에 기반하여 구성 요소를 분리합니다. 예를 들어, HPLC와 SFC 간에는 여러 유사점이 있습니다. SFC는 등용매 및 그래디언트 분석법 조건을 모두 이용하여 실행할 수 있으며 자외선(UV), 광다이오드 배열(PDA), 증기화 광산란(ELS), 질량분석(MS)과 같은 모든 표준 검출 기술과 호환됩니다. 일반적인 분취용 SFC 워크플로우는 분석법 개발, 스케일 업, 분획 분취 및 분취된 분획물의 순도 분석을 포함하는 HPLC와 동일합니다(그림 3). 일부 응용 분야의 회수율은 SFC가 더 나은 반면 그 외에는 HPLC가 보다 나은 솔루션이기 때문에 회수율 및 순도 측면에서 RPLC와 비견됩니다.

SFC는 일반적으로 순상 크로마토그래피의 원리를 이용합니다. SFC가 HPLC와 다른 점은 헥산 및 헵탄과 같은 무극성 액체 성분을 대체하는 이동상의 주요 구성 요소로서 CO₂를 사용한다는 점입니다. 초임계 CO₂는 압축 가능한 유체이므로 압력과 온도가 용매 강도를 제어하는 데 사용되는 중요한 변수가 되어 머무름과 선택성에 영향을 미치게 됩니다. 초임계 CO₂는 인화성이 없고 독성이 없으며 확산성이 높고 점도가 낮으며 용매력이 우수하기 때문에 크로마토그래피 정제에 유리합니다. SFC는 용매 소비량 절감 및 생산성 측면에서 상당한 이점을 제공함으로써 최근 몇 년 동안 정제 작업을 수행하는 실험실에 매력적으로 다가왔습니다.

분취용 SFC의 주요 이점은 이동상의 대부분을 CO₂로 대체함으로써 용매 사용량이 줄어든다는 것입니다. 분석 스케일에서는 이 이점이 작은 효과일 수 있지만, 분취 스케일에서 이는 상당히 중요한 역할을 합니다. 여러 정제 실험실에서 분취된 분획물에서 용매를 제거하는 데 상당한 시간이 소요되어 화합물을 정제하는 것과 원하는 표적 생성물 또는 결과물을 얻는 것 사이에 병목이 발생할 수 있습니다. 분취용 SFC에서 이동상의 CO₂ 부분은 감압 시 제거되며, 소량의 보조 용매(co-solvent)만 존재하게 됩니다. 생성된 분획물은 더 높은 생성물 농도를 가지며, 이는 용매 제거 및 생성물 분리에 필요한 시간을 감소시킵니다. 분획물은 또한 샘플 농축 또는 농축 단계 없이 직접 분석할 수 있습니다. 이는 일반적으로 장기적이고 건조한 조건에서 빠르게 분해되는 화합물에 특히 중요합니다.

SFC의 낮은 유기 용매 사용량이 제공하는 또 다른 이점은 비용 절감, 가연성 및 독성에 대한 안전성, 그리고 환경에 대한 영향 감소입니다. 용매의 수급 및 폐기 측면에서 상당한 비용 이점이 있지만, 용매 제거에 필요한 에너지 소비량 감소로 인한 절감 효과도 있습니다. SFC는 또한 RPLC에 사용되는 아세토니트릴과 같은 독성 용매와 NPLC에 사용되는 지방족 탄화수소 및 염화 용매의 사용을 방지할 수 있습니다. CO₂는 여러 산업 프로세스에서 생성되는 부산물이며, 이를 용매로 사용하면 재활용이 가능하기 때문에 상대적으로 저렴합니다.

분취용 SFC 이점: 생산성 향상

SFC에서는 이동상의 낮은 점도와 높은 확산성으로 인해 생산성이 증가하여 크로마토그래피 속도와 효율성을 향상시킵니다. 그림 4는 HPLC, UPLC, SFC 및 UPC²의 Van Deemter 곡선을 비교한 것입니다. 크로마토그래피에서 분리 속도는 부분적으로 용질이 이동상에서 확산되고 고정상을 이동하는 속도에 따라 결정됩니다. SFC의 Van Deemter 곡선은 HPLC보다 더 넓고 평평하며, 이는 유속(선형 속도)이 증가해도 크로마토그래피의 효율성이 높은 수준(낮은 플레이트 높이 값)을 유지한다는 것을 나타냅니다. SFC에서 높은 확산 계수는 고속 크로마토그래피로 직접 전환됩니다.

이동상의 낮은 점도로 인해 컬럼과 시스템 압력이 낮아 HPLC보다 최대 3~4배의 선형 속도를 지원하며 더 작은 입자 크기의 컬럼을 사용할 수 있습니다. 낮은 점도는 평형 시간 단축으로 이어집니다. 그 결과 높은 분리 효율성으로 실행 시간이 단축되어 로딩 용량이 증가하고 주입 사이클 시간이 단축됩니다. 이는 모든 분취용 크로마토그래피 프로세스에서 생산성을 향상시키기 위한 핵심적인 변수입니다. 따라서, 순수한 화합물이 더 짧은 시간 내에 생성되며 결과적으로 전체 생산성이 향상됨을 알 수 있습니다. HPLC와 SFC 간의 시간 및 생산성 절감 효과에 대한 예시를 표 2에서 확인할 수 있습니다.

SFC와 RPLC 간의 직교 관계는 많은 응용 분야에서 제품 품질을 향상시킬 수 있는 기회를 제공합니다. RPLC는 C₁₈ 컬럼을 거의 보편적인 솔루션으로 적용하여 분석법 개발을 매우 단순화하지만, 수용성 이동상은 용매 적합성과 화합물 용해성의 범위를 제한합니다. 반면에, SFC는 광범위한 유기 희석액에서 잘 작동하므로 용매 및 화합물과의 호환성이 보다 넓습니다. 선택할 수 있는 고정상의 범위도 폭넓습니다.

SFC는 일반적으로 순상 크로마토그래피로 간주되고 사용이 간편한 크로마토그래피 형식으로 다양한 분리 옵션을 제공하기 때문에 RPLC와 직교합니다. 특히, SFC의 경우 순상 선택성과 높은 분리 효율성이 결합되어 입체 이성질체, 위치 이성질체 및 구조적으로 유사한 화합물을 분리할 경우 이점을 얻을 수 있습니다. 무극성 화합물의 경우, SFC의 유연성은 역상 컬럼(예: C₁₈)을 사용할 수 있게 하는 반면, 첨가물로 물을 사용하면 응용 범위가 극성 영역으로 확장됩니다. 화합물이 쉽게 분해되는 이러한 응용 분야에서, SFC 정제는 물 없이 빠르게 분리가 수행되고, 낮은 온도와 더 짧은 시간 내에 분취물 건조가 이루어지기 때문에 이상적인 대안입니다.

분취용 SFC는 회수율 및 순도 측면에서 RPLC와 견줄 만하며, SFC와 RPLC 두 가지 모두에 의해 수행될 수 있는 응용 분야에 있어서 공통되는 부분이 있습니다. 그림 5는 SFC와 LC에 의한 정제에 대해 화합물의 제약적 라이브러리를 선별한 연구 결과를 보여줍니다. 약 82%의 화합물은 두 가지 기술로 정제할 수 있습니다. 그러나 이 연구는 두 플랫폼이 어떻게 보완적인지도 보여줍니다. 일부 화합물은 SFC를 통해서만 정제(4%)될 수 있는 반면, 다른 화합물은 LC를 통해서만 정제(8%)될 수 있었습니다. 두 플랫폼을 조합할 때 제공되는 유연성은 분리와 정제를 향상할 수 있는 보다 폭넓은 기회를 제공합니다. SFC는 RPLC를 보완하는 선택성을 제공하여 까다롭고 복잡한 샘플의 분리 및 분석법 개발에서 직교적 접근 방법을 허용합니다. 플랫폼 전체에 걸쳐 다단계 정제 과정을 수행하거나, 분획 분석을 위해 직교적 기술을 사용하여 보다 순수한 제품을 회수하고 보다 많은 정보를 얻을 수 있습니다. 직교 LC 및 SFC 분리를 이용하여 복잡한 매트릭스로부터 화합물을 정제하는 예시를 그림 6에서 볼 수 있습니다.