최적의 이동상 조건
용매와 컬럼에 대해 선택되는 이상적인 조합은 일반적으로 응용 분야 또는 구체적인 목표에 따라 달라집니다. 이상적인 시나리오에서는 높은 로딩, 우수한 분리능, 빠른 분리가 결합되어 고순도에서 표적 대상을 전부 회수합니다. 그러나 실제로는 가장 생산적인 솔루션을 결정하기 위해서는 절충이 필요합니다. 예를 들어, 피크가 효율적으로 분리되지만(높은 로딩 허용) 긴 실행 시간이 필요할 수 있습니다. 반면, 실행 시간이 상당히 짧은 효율적인 분리는 더 빠른 사이클 시간을 허용하지만, 로딩은 더 낮을 수 있습니다. 또 다른 고려 사항은 다운스트림 처리 과정 또는 분획물 회수율이며, 여기서 용매의 양이나 종류가 중요한 요소가 될 수 있습니다. 최종적으로 분리가 등용매 조건에서 이루어질 경우, 스택 주입이 활용될 수 있어 생산성을 크게 향상시킬 수 있습니다. 컬럼과 용매를 선택하면 스케일 업 및 정제 전에 분리를 보다 효율적으로 최적화하도록 다른 파라미터를 조절할 수 있습니다.
그래디언트 조건 최적화: SFC에서 포커싱 그래디언트는 RPLC에서와 동일하게 작동하지 않습니다. 순상 크로마토그래피에서 여러 가지 경쟁적 머무름 메커니즘으로 인해 그래디언트의 변화는 다른 분석물의 머무름 시간에 이질적인 영향을 미칠 수 있습니다. 특히 SFC에서는 그래디언트를 통한 보조 용매(co-solvent)의 증가에 수반하는 밀도 및 압력 강하의 변화가 있습니다. 보조 용매(co-solvent)의 양이 증가함에 따라 머무름 시간에 미치는 영향이 선형적이지 않아, 변화하는 조건에 따른 화합물의 선택성을 예측하기 어렵습니다. 구조적으로 유사한 화합물의 경우, 유사한 머무름 메커니즘을 따르기 때문에 문제는 거의 없습니다. 구조적으로 다른 화합물의 혼합물을 포함하는 샘플(예: 매트릭스의 경우)은 더 큰 과제에 직면하게 됩니다. 그러나 일반적으로 그래디언트가 완만할수록 머무름 시간은 길어지고 분리능은 향상됩니다.
등용매 조건 결정: 등용매 분석법은 선별 검사의 결과를 토대로 한 개발이 용이하고 스택 주입을 이용할 수 있어 생산성을 향상시킬 수 있으므로 이상적입니다. 머무름 시간, 선별 검사 그래디언트 기울기, 시스템 및 컬럼 부피 지연을 보완하는 방법을 통해 용리 시 보조 용매(co-solvent)의 비율을 결정할 수 있습니다. SFC에서 최적화를 위한 최상의 시작점은 일반적으로 계산된 비율보다 5% 낮습니다.
선별 검사 그래디언트는 5분 동안 2~20%였으며, 그래디언트 지연은 0.46분(이전 측정됨)이었습니다. 따라서 계산된 기울기는 3.6%/분이고 시작점의 비율이 2%인 경우 4.12분에서의 첫 번째 피크의 용리 시 보조 용매(co-solvent) 비율은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다.
■ 용리 시 보조 용매(co-solvent) % = (머무름 시간 – 그래디언트 지연) x 그래디언트 기울기 + 시작 %
■ 용리 시 보조 용매(co-solvent) % = (4.12분–0.46분) x 3.6 %/분 + 2%
■ 용리 시 보조 용매(co-solvent) % = 15%
따라서 5%를 뺀 후 10%의 등용매 보조 용매(co-solvent) 조건 최적화를 위한 시작점으로 사용하였습니다. 그 결과 크로마토그래피는 효율적인 분리를 보여주었지만, 이동상의 보조 용매(co-solvent) 분획물을 15%로 증가시킴으로써 피크는 더 짧은 실행 시간으로도 성공적으로 분석되었습니다. 이 경우, 10% 분석법은 더 높은 로딩을 허용하고 15% 분석법은 더 빠른 사이클 시간을 허용합니다.
