Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

Sebbene questa guida si concentri generalmente sulle fasi iniziali dell’analisi degli amminoacidi, in particolare sulla preparazione dei campioni per l’idrolisi, questa sezione presenta una breve descrizione degli approcci di quantificazione più comuni utilizzati nell’analisi degli amminoacidi. In questi esempi sono stati ottenuti i risultati dell’analisi degli amminoacidi; è necessario calcolare la concentrazione originale del campione. Questi esempi presuppongono la derivatizzazione tramite i reagenti AccQ•Tag o AccQ•Fluor.

Prima di procedere alla quantificazione:

• Verificare che tutti i picchi siano identificati correttamente.
• Se i tempi di ritenzione non corrispondono, controllare i valori nella tabella di calibrazione.
• Verificare la corretta integrazione di tutti i picchi.

Per alcune analisi, l’obiettivo è semplicemente determinare la concentrazione del campione analizzato. Questi risultati sono generalmente espressi in concentrazioni molari, per esempio µmol/L. I risultati cromatografici sono generalmente espressi in picomoli. Per determinare la concentrazione, le picomoli di amminoacido segnalate dal software cromatografico vengono divise per il volume di iniezione. Questo valore viene quindi moltiplicato per il volume di diluente diviso per il volume derivatizzato. Per completare il calcolo, moltiplicare per il fattore di diluizione, quindi convertire le unità in µmol per litro.

Esempio di calcolo:
Per determinare la concentrazione dell’amminoacido nel campione originale, in base al valore riportato, si utilizza la seguente equazione:

In cui:

pmol AA = quantità riportata per gli amminoacidi nel campione Vi = volume di iniezione in µL, in genere 1 µL

Vd = volume derivatizzato in µL, in genere 10 µL

Vr = volume del diluente utilizzato per ricostituire il campione in µL Dil. Factor = fattore di diluizione

Esempio:

Un iniziale campione proteico idrolizzato di 100 µL è stato diluito in proporzione 1:1 con lo standard interno. È stata derivatizzata un’aliquota da 10 µL. Il volume di iniezione era di 1 µI e il valore riportato era di 312,5 pmol per l’asparagina (Asn).

La concentrazione di Asn in µmol/L sarebbe:

La determinazione della composizione amminoacidica di una proteina idrolizzata comporta il calcolo dei rapporti molari dei componenti all’interno di un campione.

Ogni proteina pura possiede un numero stechiometrico di residui specifico per ogni amminoacido in essa contenuto. In una situazione ideale, i risultati di un’analisi producono rapporti molari composti da numeri interi. Il grado in cui i valori osservati si avvicinano a questo ideale è funzione della purezza della proteina o del peptide, dell’adeguatezza delle condizioni di idrolisi e della qualità dell’analisi degli amminoacidi.

Esempio 1 (come illustrato nella tabella seguente):

1. Inserire nella tabella i valori Observed Picomoles  (Picomoli osservate) per ciascun amminoacido (ottenuto dall’analisi).
2. Valutare il numero di residui (Estimated Composition, [Composizione stimata]) per ciascun amminoacido mediante ispezione. Nota: i residui osservati sono la concentrazione molare relativa di ciascunoamminoacido. Dividere tutte le picomoli osservate per l’amminoacido meno abbondante e arrotondarle alla cifra più vicina.
3. Sommare le picomoli e il numero di residui per tutti gli amminoacidi.
4. Calcolare la media pmol/residuo dividendo la somma delle picomoli osservate per la somma stimata della composizione.
5. Dividere ciascuna picomole osservata per il valore picomoli/residuo per determinare la composizione osservata.

AVVERTENZA: per le proteine di dimensioni maggiori, la stima del numero di residui è più difficile a causa della maggiore precisione richiesta.

AVVERTENZA: ilrecupero di alcuni amminoacidi da idrolisi può essere variabile (Ser, Tor, Tyr e Met sono soggetti a degradazione; i legami Val e possono essere difficili da scindere).

Nota: per migliorare la quantificazione in tali casi, si consiglia di eseguire uno studio su base temporale. In genere, i campioni vengono idrolizzati per 24, 48 e 72 (o 96) ore; i valori degli amminoacidi labili vengono determinati tramite estrapolazione a tempo zero, mentre per i valori per Ile e Val i tempi di idrolisi sono più lunghi.

Esempio 2:
In alcuni casi, come osservato in precedenza, il calcolo della percentuale in moli (numero di residui di ciascun amminoacido per 100 residui di proteina) può essere soddisfacente. La determinazione avviene come segue:

Se è disponibile una stima del peso molecolare della proteina, è possibile utilizzare due approcci per calcolare una composizione approssimata:

1. Stima del peso molecolare (MW) del campione.
2. Sommare le rese totali degli amminoacidi in picomoli.
3. Dividere il peso molecolare per 110, il peso molecolare medio degli amminoacidi. Nota: si tratta di una buona approssimazione della lunghezza totale della catena o degli amminoacidi totali.
4. Dividere la resa totale per la lunghezza della catena (uguale alla quantità molare del campione iniettato).
5. Dividere la quantità di ciascun amminoacido per la quantità molare iniettata (pari al numero di residui per mole). Esaminare le deviazioni dalle quantità integrali.
6. Alzare o abbassare leggermente il divisore (quantità molare iniettata) per minimizzare la deviazione dalle quantità integrali (ottenuta nella fase 5). Questo passaggio può essere semplificato con un foglio di calcolo del computer o un software personalizzato per gli amminoacidi in grado di calcolare le deviazioni minime.
7. Tenere presente che i valori degli amminoacidi labili e dei formatori di legami stabili possono differire in modo significativo dalle quantità integrali a causa degli scarsi recuperi derivanti dall’idrolisi.

Questa procedura alternativa richiede maggiori conoscenze sul campione.

1. Scegliere un amminoacido nell’analisi che soddisfi i due criteri seguenti:
   • Fornisce buone rese per idrolisi e derivatizzazione (per esempio, Asp, Glu, His, Arg, Ala, Pro, Leu, Phe, Lys). Gly può essere una scelta inadeguata perché è un contaminante di fondo comune; e 
   • Può avere solo pochi residui per mole di campione (in base alla stima del peso molecolare del campione e della resa amminoacidica). Tali informazioni possono essere ottenute da altre procedure, per esempio la digestione con cianogeno bromuro, che scinde selettivamente la catena polipeptidica intatta in corrispondenza della metionina.
2. Sulla base di queste informazioni, scegliere un valore integrale per questo amminoacido.
3. Dividere la resa dell’amminoacido selezionato per il valore dell’integrale scelto per ottenere la quantità molare stimata del campione iniettato.
4. Seguire la Sezione 7.3.2.1, passaggi 5 e 6.
5. Controllare i valori (uno maggiore e uno inferiore rispetto al valore integrale scelto) per vedere se si ottengono deviazioni inferiori dai numeri interi.

La concentrazione di peptidi o proteine nel campione originale può essere calcolata dalla somma dei prodotti del numero di picomoli di ciascun amminoacido moltiplicato per il corrispondente peso molecolare.

Utilizzando l’esempio riportato nella tabella della Sezione 7.3.1, il calcolo inizia come segue:

Esempio di calcolo:

Per Asp (asparagina) nel campione: 220 picomoli osservate con un peso molecolare per l’amminoacido di 133,10 g/mole danno quanto segue:

Questo stesso calcolo viene applicato a ciascun amminoacido desiderato. Nella tabella seguente sono mostrati i picogrammi calcolati per ciascun amminoacido, con la somma totale dei picogrammi di proteina iniettati dal campione in basso a destra.

I valori calcolati sopra indicati valgono anche per l’analisi di alimenti e mangimi. Tuttavia, l’informazione più importante per la maggior parte delle analisi dei mangimi è il contenuto di amminoacidi specifici che limitano la crescita, come metionina e cisteina. Il valore più comunemente di interesse è la % di contenuto di amminoacidi per peso nel campione.

Per calcolare la % per peso di un amminoacido:

Esempio di calcolo:

Il valore riportato della quantità (pmol/µL) deve essere moltiplicato per il peso molecolare residuo (gm/mol) e per eventuali fattori di conversione.

La quantità riportata in g/mol viene quindi moltiplicata per eventuali fattori di diluizione. Il risultato viene quindi diviso per il peso del campione e quindi moltiplicato per 100 per convertirlo in percentuale.

Esempio di calcolo:

In cui:

    Amount = quantità di amminoacidi in g/mL

    Diluition = diluizione del campione

Peso del campione = peso in mg

Questo metodo richiede l’utilizzo di uno standard interno.

Esempio di calcolo:

L’area del picco per lo standard interno viene moltiplicata per il peso dell’amminoacido in mg. Questo viene quindi diviso per il risultato della moltiplicazione dell’area del picco dell’amminoacido per il peso dello standard interno.

In cui:

    RF_aa = fattore di risposta per l’amminoacido

    P_n = area del picco per lo standard interno

    P_aa = area del picco per l’amminoacido nel campione

    W_aa = peso dell’amminoacido in mg

    W_n = peso dello standard interno in mg

Il calcolo del contenuto % inizia con la moltiplicazione dell’area del picco dell’amminoacido per il fattore di risposta calcolato. Questo viene quindi moltiplicato per il fattore dello standard interno. Tale numero viene quindi diviso per il moltiplicando dell’area del picco dello standard interno e per il peso del campione analizzato. Questo viene quindi convertito in percentuale.

In cui:

    P_aa = area del picco dell’amminoacido

    P_n = area del picco dello standard interno

    RF_aa = fattore di risposta calcolato

    IS = fattore standard interno calcolato

Esempio:

Per un amminoacido in un campione di mangime sono stati determinati i seguenti valori:

    Peso dell’amminoacido (W_aa) = 0,5 mg

    Area del picco dell’amminoacido (P_aa) = 100 000

    Area del picco dello standard interno (_Pn) = 110 000

    Peso dello standard interno (W_n) = 0,5 mg

    Peso della frazione per test (W_s) = 10 mg

0,5 mg x 2 x 10-2 = 0,05

L’amminoacido di interesse è presente a un livello dello 0,9% in peso del mangime.