Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

Peptidi e proteine sono costituiti da molti amminoacidi legati tra loro tramite legami peptidici. Queste biomolecole a loro volta costituiscono molti campioni diversi, come quelli bioterapeutici, gli alimenti e i mangimi. Per analizzare gli amminoacidi contenuti all’interno di queste biomolecole, è fondamentale che i legami siano idrolizzati per formare amminoacidi liberi. Tuttavia, durante questo processo le diverse proprietà chimiche dei legami amminoacidici coniugati possono influire sia sull’efficienza della scissione dei legami amminoacidici sia sul recupero dei singoli amminoacidi. Ad esempio, il recupero degli amminoacidi durante l’idrolisi può essere influenzato da specifiche reazioni chimiche, dalle interferenze della matrice dei reagenti e dalla stabilità degli amminoacidi stessi.

Date le ampie differenze nelle proprietà chimiche e fisiche di campioni e amminoacidi, nel corso degli anni sono state sviluppate diverse procedure di idrolisi. Le procedure variano in base al tipo di reazione (chimica o enzimatica), alla natura della reazione chimica (acida o base) e allo stato fisico della reazione (liquido o vapore). Le differenze possono incidere sul recupero di specifici amminoacidi, che possono essere distrutti da reagenti specifici, o sull’efficienza e sul tempo necessari per l’idrolisi. In alcuni casi possono essere necessarie più procedure di idrolisi per determinare il contenuto totale di amminoacidi di un campione. Di seguito sono descritti i tipi comuni di reazioni di idrolisi chimica e le modalità di idrolisi.

Nota: l’idrolisi enzimatica, una procedura utilizzata raramente, non è trattata in questo documento.

Si noti inoltre che le numerose reazioni di idrolisi chimica possono essere eseguite con diversi tipi di apparecchiature. Storicamente, le procedure di idrolisi hanno utilizzato una sorgente di calore sotto vuoto per garantire il completamento della reazione, ma con apparecchiature più moderne anche l’idrolisi indotta a microonde è diventata ampiamente utilizzata. I vantaggi di ciascun metodo sono diversi ed è opportuno esaminarli prima di selezionare l’attrezzatura.

1.1.1 Idrolisi acida

L’idrolisi acida è il metodo più comune per l’idrolisi di un campione proteico e può essere eseguito in fase liquida o vapore. Anche se per questa reazione è possibile utilizzare una serie di acidi diversi, il più comune è 6 M HCl. Poiché HCl è evaporativo, può essere utilizzato anche per recuperare l’idrolizzato in quantità minori di tampone, una caratteristica particolarmente utile per piccole quantità di campione. Inoltre, la versatilità di HCl ne consente l’utilizzo sia nell’idrolisi in fase liquida che in quella vapore.

La reazione di idrolisi acida con 6 M HCl porta all’aggiunta di acqua a ciascun legame peptidico covalente, ottenendo i singoli amminoacidi desiderati (Figura 1). Tuttavia, non tutti gli amminoacidi vengono completamente recuperati per idrolisi da parte di HCl. Alcuni amminoacidi sono idrolizzati nelle loro forme acide, come l’asparagina e la glutammina, che formano rispettivamente acido aspartico e acido glutammico. Inoltre, non è possibile misurare in modo affidabile altri amminoacidi. Ad esempio, il triptofano viene distrutto durante la reazione, mentre gli amminoacidi contenenti zolfo (come cisteina, metionina) non possono essere misurati in modo affidabile a causa della parziale distruzione degli amminoacidi. Inoltre, amminoacidi quali tirosina, serina e treonina possono presentare recuperi inferiori a causa della natura dell’idrolisi acida.

Tuttavia, alcuni amminoacidi solforati (ad esempio cisteina, metionina) possono essere conservati nell’idrolisi acida con HCl se viene eseguito un pretrattamento. Per quantificare accuratamente questi amminoacidi, il campione può essere ossidato o alchilato prima dell’idrolisi acida con HCl. Per l’ossidazione, in genere con acido performico, gli amminoacidi contenenti zolfo vengono ossidati prima dell’idrolisi acida con HCl. Ciò si traduce in una quantificazione accurata di questi amminoacidi nelle loro forme ossidate. L’alchilazione consente in alternativa di preservare gli amminoacidi contenenti zolfo (cisteina) per una quantificazione accurata nelle loro forme alchilate. Due dei reagenti alchilanti più comuni producono cisteina in due forme: piridiletilcisteina o carbossimetilcisteina. Un ulteriore vantaggio di questo processo di alchilazione è il fatto di non influire su altri amminoacidi.

Infine, date le difficoltà nella quantificazione di alcuni amminoacidi tramite idrolisi HCl, esistono tecniche alternative di idrolisi acida che possono essere applicate per amminoacidi specifici. Una tecnica utilizza acidi solfonici, come gli acidi metansolfonici (MSA) per quantificare il triptofano e la metionina (sotto forma di solfossido). Anche se questo reagente non è volatile, conserva il triptofano e la metionina solfossido per la quantificazione.

1.1.2 Idrolisi alcalina

Mentre l’idrolisi acida tramite HCl è di gran lunga la tecnica più comune per idrolizzare proteine e peptidi, l’idrolisi alcalina o base è spesso utilizzata per misurare il triptofano. Poiché il triptofano è stabile in condizioni alcaline, questa tecnica fornisce una quantificazione accurata del triptofano ed è ampiamente utilizzata per una varietà di campioni, dagli alimenti ai mangimi fino a peptidi e proteine. L’idrolisi alcalina in genere utilizza NaOH o KOH come reagente. Tuttavia, l’idrolisi alcalina non può sostituire l’idrolisi acida per la quantificazione di tutti gli amminoacidi. In condizioni alcaline, arginina, cisteina, serina e treonina vengono distrutte e non possono essere quantificate. Anche altri amminoacidi sono interessati, quindi l’idrolisi alcalina viene in genere utilizzata solo per il triptofano.

Le reazioni di idrolizzato vengono eseguite in fase liquida o vapore. Indipendentemente dalla modalità, la strumentazione progettata specificamente per l’idrolisi facilita la reazione. Storicamente, molte reazioni di idrolisi si sono verificate ad alte temperature e sotto vuoto in un periodo che va da alcune ore a giorni, ma con l’avvento della strumentazione di idrolisi a microonde, lo stesso processo può verificarsi nell’arco di minuti a temperature più basse.

1.2.1 Idrolisi in fase liquida

Nell’idrolisi in fase liquida, il campione e HCl vengono entrambi aggiunti direttamente alla provetta per idrolisi per la reazione. Questa procedura richiede l’aggiunta del campione, dello standard interno e dell’acido direttamente nella provetta per idrolisi. La provetta viene lavata con azoto, quindi sigillata e riscaldata per il tempo necessario a completare l’idrolisi. Il completamento dell’idrolisi liquida può richiedere da ore a giorni. Questa procedura viene in genere utilizzata per campioni più complessi.

1.2.2 Idrolisi in fase vapore

Nell’idrolisi in fase vapore, il campione reagisce solo con HCl in fase vapore. La procedura richiede il posizionamento del campione e dello standard interno (se utilizzato) in provette per idrolisi. Il campione viene quindi asciugato e ciascuna provetta viene collocata aperta in un recipiente di idrolisi. L’acido (6 M HCl) viene aggiunto sul fondo di un recipiente contenente le provette; quindi il recipiente viene sigillato, evacuato e lavato con azoto. Il recipiente viene riscaldato per il tempo necessario a completare l’idrolisi. Questa modalità riduce la contaminazione causata da reagenti impuri, per esempio HCl. L’idrolisi in fase vapore avviene in genere a una velocità maggiore rispetto all’idrolisi in fase liquida. Nell’idrolisi in fase vapore, i campioni in genere devono essere di elevata purezza.