Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

Come notato in precedenza, esistono diverse apparecchiature per agevolare l’idrolisi dei campioni. Indipendentemente dalla strumentazione, in genere esistono tre diversi protocolli di idrolisi: idrolisi acida, utilizzata per determinare la composizione proteica totale; idrolisi acida a seguito di ossidazione dell’acido performico, necessaria per misurare amminoacidi contenenti zolfo come cisteina e metionina; e idrolisi alcalina, utilizzata per valutare il recupero del triptofano. Mentre le apparecchiature tradizionali per l’idrolisi dei campioni comportano spesso un processo dispendioso in termini di tempo, la strumentazione per l’idrolisi a microonde può accelerare notevolmente la procedura. L’implementazione dell’idrolisi a microonde per tutti e tre i protocolli si traduce in un migliore controllo delle condizioni di idrolisi con accuratezza, riproducibilità, velocità e robustezza superiori.

Utilizzando la tecnologia a microonde, il reattore a microonde CEM Discover SP (CEM Corporation 3100 Smith Farm Road Matthews, NC 28104) (Figura n. 7) è in grado di idrolizzare proteine e peptidi nella preparazione per l’analisi degli amminoacidi in soli 15 minuti. Come illustrato nella Figura n. 8, l’applicazione diretta di energia a microonde e l’uso di sensori di temperatura IR integrati consentono il riscaldamento rapido e il mantenimento della temperatura impostata per ciascun campione. L’agitamento in situ assicura una distribuzione uniforme del calore nel campione, mentre il quenching post-reazione raffredda il campione in pochi secondi.

Nella sezione seguente sono descritti la configurazione e il funzionamento del sistema. Per ulteriori informazioni, contattare CEM Corporation o consultare il manuale del sistema.

• Dal punto di vista elettrico, il sistema richiede 110-140 VCA, 60 Hz, 10 A a 120 VCA.
• È necessario sfiatare il sistema.
• Il sistema richiede una pressione minima di 25 psi e una massima di 60 psi di aria compressa o azoto compresso.
• Il sistema richiede un computer portatile (fornito da CEM) da collocare a non più di 3 metri dal sistema.

• 6 N HCl per idrolisi acida, concentrazione 1:1 HCl:acqua deionizzata.
• 4 N NaOH per l’idrolisi alcalina, sciogliere 16 g di NaOH solido in 100 mL di acqua deionizzata.
• Acido performico (solo preossidazione), concentrazione 9:1 acido formico:perossido di idrogeno 30%.
• Vial da 10 o 35 mL per Discover SP con ancoretta e tappo.
• Cristalli di fenolo.

Opzione 1

1. Pesare 50-500 mg di campione in un vial da 35 mL con ancoretta.
2. Collocare le provette per digestione in un bagno di ghiaccio per circa 15 minuti.
3. Dopo il raffreddamento, aggiungere 5 mL di acido performico.
4. Coprire le provette con tappi di vetro e agitare su una piastra di agitamento magnetica a bassa velocità per 15 minuti.
5. Reinserire le provette per digestione nel bagno di ghiaccio e lasciare ossidare per 16 ore.
6. Rimuovere i tappi di vetro e aggiungere 0,84 g di metabisolfito di sodio per decomporre l’acido performico.
7. Eseguire l’idrolisi acida a partire dal passaggio 2 dell’opzione 1 nella sezione 5.4.2 Idrolisi acida.

Opzione 2

1. Pesare 50-500 mg di campione in un vial da 35 mL con ancoretta.
2. Aggiungere 6 mL di soluzione di acido performico preparata al momento (9:1 acido formico:perossido di idrogeno 30%).
3. Incubare la miscela di reazione in bagnomaria a 50 °C per un’ora.
4. Lasciare evaporare completamente la soluzione residua di acido performico in un evaporatore a 50 °C.
5. Eseguire l’idrolisi acida a partire dal passaggio 2 dell’opzione 1 nella sezione 5.4.2 Idrolisi acida.

Opzione 1: campione da 50-300 mg

1. Pesare il campione in un vial da 35 mL con ancoretta.
2. Aggiungere fenolo in quantità pari al 3% del peso.
3. Aggiungere 5 mL di 6 N HCl.
4. Chiudere il vial con il tappo.
5. Utilizzando Dynamic Method Control (Controllo del metodo dinamico), programmare un metodo con 300 W, mantenimento di 15 minuti, 195 °C e 300 psi. L’agitamento deve essere impostato su un valore alto.
6. Collocare il vial nella cavità di individuazione e premere il tasto di avvio per avviare il metodo.
7. Il campione deve riscaldarsi fino a 195 °C, a una pressione non superiore a 250 psi (±10%).

Opzione 2: campione da 300-500 mg

1. Pesare il campione in un vial da 35 mL con ancoretta.
2. Aggiungere fenolo in quantità pari al 3% del peso.
3. Aggiungere 10 mL di 6 N HCl.
4. Chiudere il vial con il tappo.
5. Utilizzando Dynamic Method Control (Controllo del metodo dinamico), programmare un metodo con 300 W, mantenimento di 15 minuti, 195 °C e 300 psi. L’agitamento deve essere impostato su un valore alto.
6. Collocare il vial nella cavità di individuazione e premere il tasto di avvio per avviare il metodo.
7. Il campione deve riscaldarsi fino a 195 °C, a una pressione non superiore a 250 psi (±10%).

Opzione 1: campione da 50-300 mg

1. Pesare il campione in un vial da 35 mL con ancoretta.
2. Aggiungere 5 mL di 4 N NaOH.
3. Chiudere il vial con il tappo.
4. Utilizzando Dynamic Method Control (Controllo del metodo dinamico), programmare un metodo con 300 W, mantenimento di 15 minuti, 195 °C e 300 psi. L’agitamento deve essere impostato su un valore alto.
5. Collocare il vial nella cavità di individuazione e premere il tasto di avvio per avviare il metodo.
6. Il campione deve riscaldarsi fino a 195 °C, a una pressione non superiore a 250 psi (±10%).

Opzione 2: campione da 300-500 mg

1. Pesare il campione in un vial da 35 mL con ancoretta.
2. Aggiungere 10 mL di 4 N NaOH.
3. Chiudere il vial con il tappo.
4. Utilizzando Dynamic Method Control (Controllo del metodo dinamico), programmare un metodo con 300 W, mantenimento di 15 minuti, 195 °C e 300 psi. L’agitamento deve essere impostato su un valore alto.
5. Collocare il vial nella cavità di individuazione e premere il tasto di avvio per avviare il metodo.
6. Il campione deve riscaldarsi fino a 195 °C, a una pressione non superiore a 250 psi (±10%).

Le impostazioni di temperatura, tempo e alimentazione dipendono dai tipi di campioni da idrolizzare. È importante garantire il funzionamento del dispositivo a microonde per l’intera durata della procedura. Ciò può richiedere una certa sperimentazione da parte dell’utilizzatore per ottimizzare al meglio i campioni utilizzando questa tecnica.

Si consiglia di rispettare le dimensioni dei campioni, i volumi e i recipienti indicati nelle procedure descritte in precedenza. Questi fattori sono critici per la riuscita dell’idrolisi. Alcuni componenti del campione rimarranno nella fase solida dopo l’idrolisi e in genere diventano di colore nero durante il processo, come mostrato nella Figura n. 9. Si tratta di un comportamento normale; gli amminoacidi saranno in soluzione. Per tutte le domande relative all’utilizzo delle apparecchiature CEM, rivolgersi a CEM Corporation all’indirizzo molecular.support@cem.com o chiamando il numero 1-704-821-7015 per comunicare con il team di preparazione dei campioni molecolari CEM.