HPLC峰形问题故障排除

HPLC分析中的一个常见问题是峰形变化。理想情况下，色谱峰应对称，呈高斯峰形[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353–362]。峰的对称性可通过计算USP拖尾因子(T)进行定量，如图1所示。拖尾因子等于1表示完全对称，值小于1时称为前延峰，值大于1时称为拖尾峰。许多方法都要求所有峰的拖尾因子必须小于指定限值。拖尾因子较高时可能会降低邻近洗脱峰的分离度，增加积分难度[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353–362]。

使用既定方法分析一批样品时，连续进样后得到的峰形有时可能会发生变化。这可能会导致拖尾因子无法满足要求。此问题可能是由多种原因导致的，包括HPLC系统、流动相、样品和色谱柱的问题[J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385-420]。在进行故障诊断排除时，建议首先仔细分析色谱图，观察出现峰形变化的是所有峰，还是仅其中一部分峰。如果是后者，则需要了解出现峰形变化的分析物的性质，确定它们与未出现峰形变化的分析物有哪些不同之处。出现问题的分析物是碱性或酸性物质，而其他分析物不是？如果是这样，原因可能是固定相表面电荷发生变化或流动相pH发生变化。如果在反相方法中，碱性分析物出现峰形变化，而其他分析物没有，根本原因之一可能是固定相的封端基团丢失，导致硅醇基团的浓度增加。基质颗粒上的离子化硅醇基团是导致碱性分析物峰拖尾的常见原因[D. V. McCalley, Chem.Comm.59 (2023), pp.7887-7899]。

如果色谱图中的所有峰都表现出相似的峰形变化，原因之一可能是连接色谱柱与HPLC系统的管路滑脱。使用PEEK手紧接头时可能会发生这种情况。另一个可能的原因是色谱柱中存在死体积，当色谱柱暴露于快速变化的压力下，或是在会导致固定相载体颗粒发生水解的pH和/或温度条件下使用时，会发生这种情况。这是硅胶基质色谱柱搭配碱性(pH>7)流动相使用时，尤其是在高温(>30 °C)下使用时的常见情况[J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr.A 691 (1995), pp.3–19., H. A. Claessens, M. A. van Straten, J. J. Kirkland, J. Chromatogr.A 728 (1996), pp.259-270]。第三个可能的原因是样品基质成分在HPLC系统和/或色谱柱中蓄积。许多样品中所含的组分可能会沉淀或强烈吸附在系统和色谱柱表面，例如蛋白质、脂质、多糖和表面活性剂。当这些组分积聚在系统和/或色谱柱表面时，可能会破坏流量分布，导致所有峰的峰形改变。

色谱图见图2。初始色谱图显示了五个峰，拖尾因子良好，范围为1.01~1.09。执行200次进样后，色谱图显示五个峰的拖尾因子均有所增加，范围为1.61~1.97。在200次进样中，柱压仅小幅增加(3.5%)。

在该分离条件下分析物均呈中性，因此固定相表面硅醇基团浓度的变化不可能成为导致拖尾峰的原因。流动相仅含水和乙腈，柱温为40 °C，因此色谱柱不太可能出现空体积。样品基质组分在色谱柱中的积聚情况如何？样品中含有蛋白质、脂肪和糖。本例所用的色谱柱具有可拆卸的一体化保护柱。更换新的保护柱后，五种组分的拖尾因子均恢复到接近1的值，如底部色谱图所示。由此确认，造成峰拖尾的原因是样品基质组分在保护柱中蓄积。如果分析样品中的基质组分可能会沉淀或强烈吸附在色谱柱上，使用保护柱是一种尽可能延长色谱柱使用寿命的低成本方法。如本例所示，对于确定峰形问题的根本原因，它也是一种有用的工具。