增加进样体积带来的峰形变化

如本系列入门指南所述，峰形变化是HPLC分析中的一个常见问题。理想情况下，色谱峰应对称，呈高斯峰形[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353–362]。峰的对称性可通过计算USP拖尾因子(T)进行定量，如图1所示。拖尾因子等于1表示完全对称，值小于1时称为前延峰，值大于1时称为拖尾峰。许多方法都要求所有峰的拖尾因子必须在指定范围内。明显偏离1的拖尾因子可能会降低邻近洗脱峰的分离度，增加积分难度[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353–362]。此外，当峰对称性较差时，峰宽通常会增加，导致峰高降低。在涉及低浓度分析物检测和定量的应用中，这可能会降低结果精密度以及定量限和检测限。

在开发低浓度分析物的定量分析方法时，优化进样体积非常重要。理想情况下，对于固定样品组成，峰高和峰面积随着进样体积的增加而线性增加，直到发生质量、体积或检测器过载[U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997, pp.355-356]。如图2A所示，使用5%~95%乙腈梯度分离了包含六种分析物的混合物，每种分析物的浓度均为0.2 µg/mL。进样体积为2 μL，使用2.1 × 50 mm色谱柱，因此进样体积为柱体积的1.1%。由于一般指导原则是进样体积应为柱体积的1–10% [沃特世知识共享平台48961]，因此似乎仍有空间通过增加进样体积来提高色谱柱的信噪比。进样体积增加至4 μL后，得到的色谱图如图2B所示。虽然六个峰的峰面积均按预期增加至两倍，但前两个峰的峰高没有增加，而是变得更宽，并出现明显的前延峰。

如前两部分所述，峰对称性发生变化可能是由多种原因导致的，包括HPLC系统、流动相、样品和色谱柱的问题[J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385-420]。如之前所讨论的，在进行故障诊断排除时建议首先仔细分析色谱图，观察出现峰形变化的是所有峰，还是仅其中一部分峰。如果色谱图中仅部分峰出现前延峰（如图2B所示），原因可能是干扰化合物共流出、样品过载或使用的样品溶剂过强。由于该问题是在增加进样体积后出现的，并且分析物浓度较低，因此最有可能是后者。图2A和2B所示色谱图使用的样品溶剂为50/50 v/v乙腈/水，这是因为某些分析物在水中的溶解度有限。由于梯度开始的乙腈浓度只有5%，因此样品溶剂的强度明显高于初始流动相。由于先洗脱的分析物疏水性较弱，因此受强样品溶剂的影响更大。为验证这一假设，用相同的分析物浓度，但采用不同的乙腈/水比例，制备了一系列样品。前两个峰的拖尾因子结果如图3所示。两种分析物的拖尾因子随乙腈浓度的增加而减小，证明使用强样品溶剂是导致图2B中出现前延峰的原因。为避免此问题，同时确保能够溶解疏水性最强的分析物，选择的乙腈浓度为10%。图2C展示了进样4 μL用10/90 v/v乙腈/水溶解的样品所得到的色谱图。与2 μL进样体积相比，现在所有峰的峰高均达到了预期的两倍，且峰对称性良好。在优化进样体积时，应始终考虑样品溶剂相对于初始流动相组成的强度。