既往所用色谱柱的峰形变化

如本系列入门指南所述，峰形变化是HPLC分析中的一个常见问题。理想情况下，色谱峰应对称，呈高斯峰形[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353–362]。峰的对称性可通过计算USP拖尾因子(T)进行定量，如图1所示。拖尾因子等于1表示完全对称，值小于1时称为前延峰，值大于1时称为拖尾峰。许多方法都要求所有峰的拖尾因子必须在指定范围内。明显偏离1的拖尾因子可能会降低邻近洗脱峰的分离度，增加积分难度[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021), pp.353–362]。

图1.根据5%峰高处测得的全峰宽(W_0.05)和5%峰高处峰前段的宽度(f)计算USP拖尾因子。

当准备在既往所用色谱柱上运行既定方法时，应进行适应性测试，检查色谱柱状态是否良好。此测试的目的是评估色谱柱和系统产生可接受压力、保留时间、峰面积、峰宽和峰对称性的能力。如果有任何一项测试结果与既往在该色谱柱上获得的结果相比发生显著变化，则可能表明该色谱柱存在问题。如图2所示，该示例采用了沃特世反相QC标准品（P/N：186006363）。该标准品包含七种化合物，使用梯度方法进行了分析。初始结果（图2A）表明，USP拖尾因子范围为0.90~1.27，未超过可接受范围。从系统中取下色谱柱然后重新连接，再执行相同的测试方法，得到的色谱图如图2B所示。虽然保留时间、峰面积和柱压与初始结果相似，但七个峰的USP拖尾因子均较高，范围为1.32~1.65。

图2.比较反相QC标准品的初始分离(A)、取下色谱柱并重新连接后的分离(B)以及重置连接后的分离(C)色谱图

USP拖尾因子

峰	A	B	C
1	0.9	1.32	0.91
2	1.27	1.61	1.27
3	1.2	1.65	1.2
4	1.1	1.46	1.09
5	1.1	1.47	1.11
6	1.11	1.44	1.09
7	1.08	1.47	1.08

如第1部分所述，峰对称性发生变化可能是由多种原因导致的，包括HPLC系统、流动相、样品和色谱柱的问题[J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385-420]。如之前所讨论的，在进行故障诊断排除时建议首先仔细分析色谱图，观察出现峰形变化的是所有峰，还是仅其中一部分峰。如果色谱图中所有峰的峰形变化相似（如图2B所示），原因可能包括色谱柱中存在死体积、色谱柱内样品基质组分蓄积或色谱柱与HPLC系统连接不良。由于之前使用该色谱柱时未发现此问题，因此不太可能是色谱柱死体积或样品基质蓄积。因此，与HPLC系统连接不良是最可能的原因。重置色谱柱连接，并再次执行适应性测试方法。如图2C所示，USP拖尾因子恢复至初始值。由此可以确认，该问题是由色谱柱连接不当引起的，导致色谱柱与系统连接管路之间存在间隙（见图3）。即使是很小的间隙也足以导致峰形畸变。有关如何将不同类型末端接头的色谱柱连接到多个HPLC系统的演示，请通过以下URL观看系列视频：如何将HPLC色谱柱连接到沃特世LC系统